血清類黏蛋白1樣蛋白3基因單核苷酸多態(tài)性與兒童肺炎支原體感染相關哮喘的相關性

襲學芹， 畢玉娜， 谷亞星， 王金榮*

1. 山東省婦幼保健院小兒呼吸科，濟南 250014 2. 山東省立第三醫(yī)院小兒呼吸科，濟南 250031 3. 山東大學附屬省立醫(yī)院兒科呼吸綜合科，濟南 250021

支氣管哮喘是一種呼吸系統頻發(fā)的異質性疾病，多在凌晨發(fā)作和(或)夜間加劇。哮喘的臨床表現主要為反復發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促和胸悶，以慢性炎性反應和氣道高反應性為特征。呼吸道癥狀的嚴重程度和具體表現形式隨時間而變化，可伴有可變的呼氣氣流受限[1]。1970年，Berkovich等[2]首次報道，支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae，MP)與哮喘患兒喘息發(fā)作有直接聯系。近年來關于哮喘病因學的研究逐漸增多。有學者提出，MP感染為哮喘急性發(fā)作的重要誘發(fā)因素，并且是小兒哮喘遷延不愈、反復發(fā)作的主要獨立危險因素。

另外，目前認為哮喘是一種多基因遺傳病，是由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用而形成的。研究[3]證實，人血清類黏蛋白1樣蛋白3(orosomucoid 1-like protein 3，ORMDL3)基因多態(tài)性與哮喘密切相關。ORMDL3基因位于17號染色體上，有3個外顯子和2個內含子，編碼1個位于內質網膜的跨膜蛋白，可以調節(jié)Ca2+濃度，從而導致未折疊蛋白反應，進而成為炎性反應發(fā)生的內源性誘因。為探討ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性與兒童MP感染相關哮喘的相關性，本研究選取ORMDL3基因的rs4794820和rs7216389這2個位點進行基因型分析，比較各基因型在MP哮喘組與MP非哮喘組的分布差異，以期為兒童MP感染相關哮喘的早期識別和干預治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2015年12月山東大學附屬省立醫(yī)院兒科診治的200例MP住院患兒。隨訪觀察1年以上，失訪6例，最后納入194例MP住院患兒為研究對象。所有入組患兒的治療及臨床資料使用均取得監(jiān)護人同意，并由其簽署知情同意書。根據我國2008年《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[4]及《2015年全球哮喘防治創(chuàng)議》[5]關于兒童哮喘的診斷標準，將有反復或持續(xù)咳嗽和(或)喘息的患兒分為MP哮喘組，無上述表現的患兒為MP非哮喘組。收集所選患兒的血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平等資料。所有入選患兒均按照操作規(guī)范，測量身高、體質量，并進行體格檢查。

入選標準：(1)年齡3～12歲；(2)已于院外或入院后確診為MP，診斷標準符合中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組2013年修訂的《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南》[6]和2015年《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識》[7]中MP的診斷標準；(3)患兒或監(jiān)護人能正確理解研究內容，并能清楚描述患兒發(fā)病情況。排除標準：(1)3代直系親屬中有其他遺傳性疾病者；(2)存在先天性支氣管或肺發(fā)育異常、支氣管擴張、氣管內阻塞或氣管外壓迫、肺結核或先天性心臟??；(3)既往1年內有反復或持續(xù)咳嗽及喘息表現；(4)近期合并其他病原體引發(fā)的呼吸道感染者；(5)無法取得家長的知情同意者。

1.2 哮喘易感基因ORMDL3 rs4794820、rs7216389基因型檢測 所選兒童均于入院當天治療前留取外周靜脈血3 mL，采用天根自動核酸提取儀(TGuide S32 Nucleic Acid Extractor)提取目的基因ORMDL3。根據ORMDL3基因中哮喘易感的2個位點(rs4794820、rs7216389)序列設計引物。

rs4794820引物序列ASP1：5′-AGG AAG GAA GGA AGA AAG ACA G-3′，ASP2：5′-AGG AAG GAA GGA AGA AAG ACA A-3′，產物大小260 bp。rs7216389引物序列ASP1：5′-GCA ACC CTG GAA AGT CAC AAA CAT-3′，ASP2：5′-GCA ACC CTG GAA AGT CAC AAA CAC-3′，產物大小150 bp。

應用Bio-MarkTM96.96動態(tài)陳列集成流體通路(integrated fluidic circuit，IFC)Juno系統對哮喘易感基因ORMDL3的rs4794820、rs7216389基因型進行檢測。檢測結果用Fluidigm SNP Genotyping Analysis軟件分析。

1.3 血清IgE水平檢測 清晨空腹采集靜脈血2 mL，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定血清IgE水平。ELISA試劑盒為北京歐蒙生物技術有限公司產品，操作過程由檢驗科醫(yī)師嚴格按照說明書進行。

2 結 果

2.1 一般資料的比較 194例患兒中，男性136例(70.1%)，女性58例(29.9%)，男女比例為2.3∶1。MP哮喘組患兒63例(32.5%)，其中，男性患兒45例(71.4%)，女性患兒18例(28.6%)，男女患兒比例為2.5∶1。MP非哮喘組患兒131例(67.5%)，其中，男性患兒91例(69.5%)，女性患兒40例(30.5%)，男女患兒比例為2.3∶1。MP哮喘組平均年齡(6.43±1.82)歲，MP非哮喘組平均年齡為(6.13±2.09)歲，兩組年齡構成分布差異無統計學意義。

2.2 MP哮喘與ORMDL3基因rs4794820位點基因型分布的關系 結果(表1)表明：在ORMDL3基因的rs4794820位點有 AG、GG、AA共3種基因型，MP哮喘組和MP非哮喘組在此位點均以純合子GG基因型的分布頻率最高、純合子AA分布頻率最低；兩組在此位點的基因型差異均有統計學意義(P<0.05)。MP哮喘組GG純合子基因型和G等位基因頻率均明顯高于MP非哮喘組，但MP非哮喘組AA純合子基因型和A等位基因頻率明顯高于MP哮喘組；兩組此位點的等位基因差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3 MP哮喘與ORMDL3基因 rs7216389位點基因型分布的關系 結果(表2)表明：ORMDL3基因的rs7216389位點有TT、TC、CC 共3種基因型，MP哮喘組和MP非哮喘組在此位點均以純合子TT基因型的分布頻率最高、純合子CC分布頻率最低；兩組在此位點的基因型分布差異有統計學意義(P=0.002)。MP哮喘組的TT純合子基因型和T等位基因頻率明顯均高于MP非哮喘組(P<0.05)；MP非哮喘組CC純合子基因型和C等位基因頻率明顯高于MP哮喘組。兩組此位點等位基因差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 MP哮喘組和非哮喘組患兒ORMDL3基因rs4794820位點的基因型分布 n(%)

*P<0.05與MP非哮喘組相比

表2 MP哮喘組和非哮喘組患兒ORMDL3基因rs7216389位點的基因型分布 n(%)

*P<0.05與MP非哮喘組相比

2.4 rs4794820 GG基因型和rs7216389 TT基因型的MP哮喘危險度分析 結果(表3)表明：MP哮喘組在哮喘易感基因ORMDL3的rs4794820位點GG基因型分布頻率(60.3%)明顯高于AG+AA基因型(39.7%)，在rs7216389位點 TT基因型(65.1%)明顯高于TC+CC基因型(34.9%)；MP非哮喘組在ORMDL3的rs4794820位點GG基因型分布頻率(42.7%)低于AG+AA基因型(57.3%)，在rs7216389位點 TT基因型(45.0%)低于TC+CC基因型(55.0%)。MP哮喘組哮喘易感基因ORMDL3的rs4794820位點GG基因型分布頻率(60.3%)和rs7216389位點 TT基因型分布頻率(65.1%)均明顯高于MP非哮喘組，兩基因型均為MP哮喘發(fā)生的危險因素(P=0.022，P=0.009)。

表3 哮喘易感基因ORMDL3 rs4794820 GG基因型和rs7216389 TT基因型的危險度分析 n(%)

2.5 MP哮喘與血清IgE水平的關系 ELISA結果顯示：63例MP哮喘組患兒血清IgE水平升高者18例(28.6%)，131例MP非哮喘組患兒中19例血清IgE水平升高(14.5%)，兩組間差異有統計學意義(χ2=5.188，P=0.023)。

3 討 論

目前，我國兒童哮喘的總體控制水平尚不理想，其發(fā)病率在近年來不斷升高，給家庭及社會帶來了沉重負擔，也嚴重損害著兒童身心健康。哮喘是一種多基因遺傳疾病，遺傳度高達80%，具有明顯的家族傾向性，其發(fā)病與遺傳易感性和環(huán)境暴露的相互作用有關[8-9]。Ober等[10]的薈萃性分析結果發(fā)現，共有118個基因與哮喘或變應性疾病相關。有學者利用全基因組關聯性研究[3]分析發(fā)現，ORMDL3 基因是兒童哮喘的潛在候選基因。

MP是一種通過黏附及細胞毒效應對呼吸道上皮細胞形成直接損傷，也通過免疫機制引起肺部感染及肺外系統損傷的細胞外病原體[11]，可引起咽炎、支氣管炎和肺炎，誘發(fā)和加重哮喘[12]。目前，對于小兒MP有無性別差異，相關報道結論不一，考慮與不同地區(qū)男女患兒的構成比差異較大有關。本研究納入的194例MP患兒中，男性患兒約為女性患兒的2.3倍，提示在本研究病例中男性MP感染陽性率高于女性。已有文獻顯示，哮喘初發(fā)患者中，MP陽性率為50%以上，復發(fā)患者中約為20%，而哮喘急性發(fā)作期的MP陽性率為34.0%[13]。王曄等[14]研究發(fā)現，哮喘患兒的MP陽性率為48.8%，以學齡期兒童最高(達57.6%)。本研究顯示，MP哮喘組的MP陽性率約為32.5%，比文獻統計數據值偏低。這可能與本次研究選取患兒的病情較重，而一些病情較輕或癥狀不典型的患兒未納入研究有關。

2007年，Nature首次報道ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性控制的遺傳變異與哮喘發(fā)作高度相關[15]，攜帶該基因遺傳變異的兒童患哮喘的風險增加60%～70%。目前ORMDL3基因作為哮喘易感基因的相關機制研究正在進行中。有研究[15]顯示，ORMDL3基因參與哮喘發(fā)病，推測ORMDL3能結合肌質網，抑制其三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase，ATP)活性，進而降低內質網中的ATP濃度，促進非折疊蛋白中激活轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)通路，活化的ATF6 通路促進肌質網鈣泵的表達，進而促進炎性反應，引起氣道高反應性，使患兒對哮喘的易感性增加，引發(fā)哮喘。之后有研究提出，ORMDL3蛋白有3種異構體[16]，是絲氨酸棕櫚酰轉移酶(serine palmitoyl transferase, SPT)的抑制劑，可作為鞘脂合成的限速酶，通過SPT抑制鞘脂的合成，調節(jié)機體內神經酰胺的產生，發(fā)揮負性調節(jié)作用；并且其可以獨立于過敏或炎性反應。

目前，ORMDL3基因的單核苷酸多態(tài)性位點rs4794820、rs7216389已經被廣泛研究。其中，rs4794820參與上皮細胞炎性反應和氣道反應性的調節(jié)；rs7216389則因其堿基由C改變?yōu)門，影響了ORMDL3基因的表達，從而在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。韓國兒童中，rs4794820位點基因型為AG和AA的哮喘患兒相較于GG基因型的患兒，肺功能損害較低，嗜酸性粒細胞水平也更低[17]。Tavendale等[18]研究發(fā)現，蘇格蘭兒童中rs7216389位點為TC基因型的群體有發(fā)展為持續(xù)性哮喘的高危險性。本研究發(fā)現，rs4794820位點GG基因型和G等位基因在MP哮喘組的分布頻率明顯高于MP非哮喘組，而rs7216389位點TT基因型和T等位基因在MP哮喘組的分布頻率明顯高于MP非哮喘組；在基因型危險度分析中，rs4794820位點GG基因型和rs7216389位點TT基因型均是兒童MP相關哮喘的危險因素，而rs4794820位點AA基因型和rs7216389位點CC基因型則可能是兒童MP感染相關哮喘的保護因素。

IgE屬于免疫球蛋白，可誘發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應，導致患兒出現可逆的氣管阻塞，誘導哮喘發(fā)作。多項研究顯示，MP感染后可導致IgE水平升高；IgE既可以是感染源，也可以是特異的過敏原[19]。MP感染患兒具有更高水平的促炎細胞因子，總IgE水平升高[20]。MP引起的呼吸道炎性反應和Th2細胞因子反應增加導致T淋巴細胞免疫功能失常，Th1/Th2比例降低。這是形成哮喘的啟動因素，并在哮喘發(fā)展中成為維持因素，提示MP可誘發(fā)和加重哮喘。本研究顯示，MP哮喘組患兒血清IgE水平升高的比例高于MP非哮喘組，提示MP感染后IgE水平升高是支氣管哮喘患兒發(fā)病的重要危險因素，需要在臨床工作中引起重視，早期識別，以避免哮喘的發(fā)生。

綜上所述，MP相關哮喘患兒的病例對照研究發(fā)現，MP相關哮喘的發(fā)病率升高，而且ORMDL3基因rs4794820位點GG純合子基因型和rs7216389位點TT純合子基因型是兒童MP感染相關哮喘的易感基因型，rs4794820位點AA基因型和rs7216389位點CC基因型可能是其保護基因型；MP感染后血清IgE水平升高，是MP感染相關哮喘的潛在危險因素。