米根霉α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的理性設(shè)計(jì)

楊倩，湯斌，李松

?

米根霉α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的理性設(shè)計(jì)

楊倩，湯斌，李松

安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

真菌α-淀粉酶被廣泛應(yīng)用于麥芽糖漿生產(chǎn)工業(yè)，但其熱穩(wěn)定性普遍較差，在制糖工藝中增加了由于酶活力損失而引起的追加生產(chǎn)成本。在充分研究了熱穩(wěn)定性對(duì)于真菌α-淀粉酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的重要性的基礎(chǔ)上，為提高米根霉α-淀粉酶 (ROAmy) 的熱穩(wěn)定性，基于酶蛋白B-factor分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬，利用重疊PCR技術(shù)分別對(duì)ROAmy中的3個(gè)氨基酸殘基G128、K269和G393進(jìn)行了單點(diǎn)突變及組合突變。結(jié)果表明，所獲得的7個(gè)突變體均比原酶具有更好的熱穩(wěn)定性，其中效果最好的為組合突變體G128L/K269L/G393P，其在55 ℃下的熱失活半衰期 (1/2) 約為原酶的5.63倍。同時(shí)，該突變體的最適溫度由50 ℃提高到了65 ℃，最大反應(yīng)速率 (max) 和催化效率 (cat/m) 分別提高了65.38%和99.86%。通過蛋白結(jié)構(gòu)功能比較分析，發(fā)現(xiàn)氫鍵數(shù)目的增多或脯氨酸在特殊位置中的引入可能是突變體熱穩(wěn)定性得到提高的主要因素。

真菌α-淀粉酶，B-factor，定點(diǎn)突變，熱穩(wěn)定性，分子動(dòng)力學(xué)模擬

真菌α-淀粉酶 (EC 3.2.1.1) 主要指一類真核微生物來源的α-淀粉酶，其不僅能夠水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，也能水解麥芽三糖，終產(chǎn)物中的主要物質(zhì)為麥芽糖、部分寡糖以及少量的葡萄糖[1-2]。由于真菌α-淀粉酶具有特殊的高麥芽糖生成能力，使其在很多工業(yè)上的應(yīng)用逐年增加，例如高麥芽糖漿、烘焙和釀造工業(yè)等[3-4]。目前大部分商用真菌α-淀粉酶在麥芽糖漿生產(chǎn)中的最適作用溫度在50–55 ℃之間[5]，在該溫度條件下，糖液在長(zhǎng)時(shí)間的處理過程中容易被嗜溫微生物污染而變質(zhì)[6]，而當(dāng)反應(yīng)溫度超過60 ℃時(shí)酶的催化效率和活力單位會(huì)急劇下降。因此，提高真菌α-淀粉酶的耐熱性將有助于改善制糖工藝以減少糖液感染嗜溫細(xì)菌的幾率并降低生產(chǎn)成本[7]。

由于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響因素眾多，目前還沒有一種通用的蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)方法。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，通常在對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上利用B-factor、脯氨酸效應(yīng) (Proline theory)、折疊自由能或是同源比對(duì)等方法設(shè)計(jì)突變體以獲得熱穩(wěn)定性提高的突變株。其中，B-factor (或B-value) 表示蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中原子的位移參數(shù)，可反映蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象，某一殘基的B-factor越高，其相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定或柔性越強(qiáng)[8-9]。實(shí)驗(yàn)表明對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中B-factor較高的殘基進(jìn)行突變，部分突變體的溫度穩(wěn)定性得到了明顯的提高[10-11]。同時(shí)，可以對(duì)B-factor較高的氨基酸進(jìn)行飽和突變以獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12-13]。然而這種方法需要構(gòu)建并篩選大量的突變體，將耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間。計(jì)算機(jī)輔助分子動(dòng)力學(xué)模擬可在原子或分子水平上描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中分子的運(yùn)動(dòng)過程，這種模擬技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的定向改造[14]。因此，在獲取B-factor的基礎(chǔ)上再根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果進(jìn)一步理性設(shè)計(jì)并快速選擇合理的突變位點(diǎn)，是一種較為便捷、有效的蛋白質(zhì)改造方法，例如：Huang等利用B-factor和折疊自由能計(jì)算方法，對(duì)一種轉(zhuǎn)氨酶的柔性區(qū)域進(jìn)行了突變，其中效果最好的突變體T130M/E133F在40 ℃下的熱失活半衰期 (1/2) 是原酶的3.3倍[15]；Li等利用多序列比對(duì)和PoPMuSiC算法輔助設(shè)計(jì)，構(gòu)建了7個(gè)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶突變體，其中最穩(wěn)定的突變體在95 ℃下的1/2是原酶的9倍[16]。

為提高米根霉α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性并揭示與耐熱性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸結(jié)構(gòu)，本研究基于B-factor和分子動(dòng)力學(xué)模擬輔助設(shè)計(jì)，利用重疊PCR技術(shù)對(duì)3個(gè)潛在的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行了單位點(diǎn)突變和組合突變，同時(shí)對(duì)各突變體的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

含有米根霉α-淀粉酶基因 () 的重組質(zhì)粒pUC57-為本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中構(gòu)建。其中，基因(GenBank登錄號(hào)HM234170) 克隆自菌株米根霉F0071。菌株大腸桿菌JM109和克魯維乳酸酵母GG799以及質(zhì)粒pUC57和pKLAC1為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 工具酶、試劑盒及引物

實(shí)驗(yàn)中所使用的各種限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶以及質(zhì)粒抽提、PCR產(chǎn)物純化和膠回收等試劑盒分別購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司或生工生物工程 (上海) 股份有限公司。PCR引物由生工生物 (上海) 股份有限公司合成，具體信息如表1所示。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，其中固體LB培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉。YEPD培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，自然pH。YEPG培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，半乳糖20，自然pH。YCBA培養(yǎng)基 (g/L)：酵母碳基10，乙酰胺0.3，瓊脂粉15，自然pH?；钚院Y選培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，可溶性淀粉2，自然pH。

1.1.4 試劑

酵母碳基 (YCB) 為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的生化或分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

以米曲霉α-淀粉酶晶體結(jié)構(gòu) (PDB：2taa) 為模板，利用軟件Swiss Model Server (https://swissmodel. expasy.org/) 建立米根霉α-淀粉酶 (ROAmy) 及其突變體的三維 (3-D) 結(jié)構(gòu)模型。所構(gòu)建模型的質(zhì)量進(jìn)一步利用Profile-3D、拉曼圖和軟件Molprobity (http://molprobity.biochem.duke.edu/) 進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)，通過B-FITTER軟件計(jì)算ROAmy中所有氨基酸的B-factor[17]。利用生物學(xué)軟件Discovery studio 2.5進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬。以ROAmy及其突變體為受體，以從NCBI (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 的PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的麥芽三糖分子 (3D conformer，PubChem CID: 192826) 為配體進(jìn)行分子對(duì)接。將對(duì)接好的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物導(dǎo)入Discovery studio 2.5進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，賦予模擬體系CHARMm力場(chǎng)，然后模擬對(duì)復(fù)合物添加溶液環(huán)境，設(shè)置動(dòng)力學(xué)模擬各項(xiàng)參數(shù)。在模擬結(jié)束后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算所得的軌跡計(jì)算蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物之間的相互作用能。

1.2.2 突變體的構(gòu)建和篩選

在計(jì)算機(jī)輔助分析的基礎(chǔ)上，利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了7個(gè)突變體。根據(jù)ROAmy成熟肽編碼序列，設(shè)計(jì)了上游引物ROAmy-F和下游引物ROAmy-R，分別引入限制性酶切位點(diǎn)Ⅰ和Ⅰ。同時(shí)根據(jù)密碼子使用，設(shè)計(jì)了引入突變位點(diǎn)的引物 (表1)。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物純化后使用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后與經(jīng)同樣雙酶切的pKLAC1相連接并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，將篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。驗(yàn)證正確后提取重組質(zhì)粒并經(jīng)Ⅱ線性化后通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入GG799感受態(tài)細(xì)胞。重組酵母使用YCBA平板進(jìn)行篩選并進(jìn)行單菌落分離，將分離的單菌落分別點(diǎn)種至活性篩選培養(yǎng)基，在30 ℃靜置培養(yǎng)48 h后使用稀碘液染色，篩選淀粉水解透明圈直徑較大的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

表1 本研究所用引物

Underlined letters are restriction enzyme cut sites and italic letters are His-tag coding sequence.

1.2.3 重組菌的發(fā)酵及酶液純化

接種重組酵母單菌落于10 mL YEPD培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，取1 mL培養(yǎng)液接種于50 mL YEPG培養(yǎng)基中并在同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)36 h。發(fā)酵結(jié)束后通過離心 (8 000 r/min，5 min) 去除酵母細(xì)胞，上清液經(jīng)硫酸銨鹽析、金屬親和層析 (HisTrapTMHP 1 mL column，GE Healthcare)、脫鹽 (HiTrapTM5 mL，GE Healthcare) 等步驟進(jìn)行純化，得到電泳純的蛋白質(zhì)之后將酶液進(jìn)行真空冷凍干燥得到酶粉并貯存于4 ℃，使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒚阜廴芙庥诓煌琾H值的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液 (0.2 mol/L) 中。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[18]。利用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度。

1.2.4 重組酶酶學(xué)性質(zhì)以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

酶活測(cè)定按照文獻(xiàn)[19]所述的淀粉-碘液法測(cè)定。具體為：取240 μL可溶性淀粉溶液 (2 g/L) 與240 μL酶液混合，于55 ℃下反應(yīng)10 min后加入120 μL HCl溶液 (0.1 mol/L) 終止反應(yīng)，再向體系中加入600 μL稀碘液 (5 mmol/L I2和5 mmol/L KI)，混合均勻后在580 nm處測(cè)定吸光值以對(duì)反應(yīng)液中殘余淀粉進(jìn)行定量。一個(gè)α-淀粉酶活力單位 (U) 定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘消耗1 mg可溶性淀粉所需要的酶量。反應(yīng)中所使用的酶液指將一定量的酶粉溶解于檸檬酸-Na2HPO4緩沖液 (0.2 mol/L，pH 5.0) 而獲得的淀粉酶溶液。

最適反應(yīng)溫度測(cè)定：在pH 5.0條件下，分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃條件下測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，以確定酶的最適反應(yīng)溫度。

溫度穩(wěn)定性測(cè)定：將酶液使用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液 (0.2 mol/L，pH 5.0) 稀釋至5 U/mL并于55 ℃條件下保溫不同時(shí)間后取出，在冰上放置30 min后測(cè)定殘余酶活力，并以未保溫的樣品所測(cè)定的酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，以比較酶的熱穩(wěn)定性。熱失活半衰期 (1/2) 利用公式1/2= ln2/d計(jì)算，其中d為一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)[20]。

最適反應(yīng)pH測(cè)定：在55 ℃條件下，分別在pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的緩沖體系中測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，確定酶的最適反應(yīng)pH。

pH穩(wěn)定性測(cè)定：將酶粉溶解于不同pH值的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液 (0.1 mol/L，pH 3.0–7.5) 中并于55 ℃下保溫10 min后取出，在冰上放置30 min并使用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液 (0.2 mol/L，pH 5.0)，稀釋10倍后測(cè)定剩余酶活力，以未保溫的樣品測(cè)定的酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力以確定酶的pH穩(wěn)定性。

米氏常數(shù)的測(cè)定：使用不同濃度的可溶性淀粉溶液 (0.2–6.0 mg/mL) 為底物，在標(biāo)準(zhǔn)酶活力測(cè)定條件下測(cè)定α-淀粉酶活力，并依據(jù)Lineweaver- Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算酶對(duì)可溶性淀粉的米氏常數(shù)m和max。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)的測(cè)定均做3組平行，數(shù)據(jù)以平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (如有需要) 形式呈現(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算以及顯著性分析 (-test) 均利用軟件OriginPro 2015 (OriginLab Corporation) 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ROAmy的結(jié)構(gòu)建模分析與突變體的設(shè)計(jì)

ROAmy的氨基酸序列與米曲霉α-淀粉酶 (PDB：2taa) 的氨基酸序列相似度高達(dá)45%，以其為模板，利用Swiss Model Server對(duì)ROAmy建立3D結(jié)構(gòu)模型經(jīng)過評(píng)估后用于后續(xù)的分析。為合理、快速地選擇待突變位點(diǎn)，研究中首先利用軟件B-FITTER計(jì)算ROAmy中所有氨基酸的B-factor，其中B-factor值較高的前10個(gè)氨基酸殘基如表2所示。

研究中選擇了B-factor值較高的前3個(gè)氨基酸殘基G128、K269和G393進(jìn)行分析并得到這3個(gè)殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的位置 (圖1)，結(jié)構(gòu)模擬表明這3個(gè)殘基分別位于ROAmy中Domain B的無規(guī)則卷曲處、Domain A的 (α/β)8TIM桶狀結(jié)構(gòu)的第6個(gè)α-螺旋及Domain C處。

進(jìn)一步利用Discovery studio 2.5軟件將以上3個(gè)殘基分別替換為其他19種氨基酸并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，結(jié)果顯示G128L、K269L和G393P的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物之間的相互作用能最低 (表3)。為研究各殘基突變的單獨(dú)作用和累積效應(yīng)，利用重疊PCR技術(shù)分別獲得了3個(gè)單突變體(G128L、K269L和G393P) 以及4個(gè)組合突變體 (G128L/K269L、K269L/G393P、G128L/G393P和G128L/K269L/G393P)。

表2 ROAmy中B-factor值較高的前10個(gè)氨基酸殘基

圖1 ROAmy的3D結(jié)構(gòu)模型

表3 ROAmy及其突變體蛋白-配體相互作用能

2.2 溫度對(duì)酶活力及酶蛋白穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)酶活力影響研究結(jié)果顯示，與原酶ROAmy的最適反應(yīng)溫度 (50 ℃) 相比，所有突變體的最適反應(yīng)溫度均產(chǎn)生了偏移。其中，突變體G393P的最適反應(yīng)溫度為65 ℃，其他6個(gè)突變體的最適反應(yīng)溫度為60 ℃ (圖2A)。熱穩(wěn)定性研究表明，所有突變體的熱失活半衰期均得到了不同程度的提升 (圖2B)，突變體G128L、K269L、G393P、G128L/K269L、K269L/G393P、G128L/ G393P和G128L/K269L/G393P的熱失活半衰期分別約為原酶的1.20、2.56、5.20、2.79、3.07、3.35和5.63倍，表明突變體的熱穩(wěn)定性得到了顯著提升，尤其是組合突變體G128L/K269L/G393P。

2.3 pH對(duì)酶活力及酶蛋白穩(wěn)定性的影響

pH作用條件研究表明7個(gè)突變體的最適反應(yīng)pH均與原酶相似，即在pH 5.5時(shí)具有最高催化活力 (圖3A)。其中，在pH 4.0和pH 4.5條件下部分突變體的催化活力得到了提高，如組合突變體原酶的1.44、1.31、1.23、1.28倍。此外，與原酶相比，各突變體在更高的pH條件下亦表現(xiàn)出了較高的催化活力，突變體G128L、K269L和G128L/K269L/G393P在pH 7.0時(shí)的催化效率分別約為G128L/K269L、K269L/G393P、G128L/G393P和G128L/K269L/G393P在pH 4.5時(shí)的催化效率分別約為原酶的2.32、2.06、1.76倍 (圖3A)。然而pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果顯示7個(gè)突變體在pH值低于5.0條件下的穩(wěn)定性較原酶略有下降，僅在pH值高于5.5時(shí)表現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性 (圖3B)。

圖3 pH對(duì)ROAmy及其突變體酶活力(A) 和穩(wěn)定性(B) 的影響

Fig. 3 Effect of pH on the activity and stability of ROAmy and its mutants. (A) The optimum pH of ROAmy and mutants. (B) The pH stability of ROAmy and mutants.

通過與原酶相比較可以發(fā)現(xiàn)，各突變體在相對(duì)偏堿性的范圍內(nèi) (pH 6.0–7.5) 表現(xiàn)出了更高的催化活力和穩(wěn)定性。

2.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

在熱穩(wěn)定性得到提高的同時(shí)，酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究表明各突變體在底物結(jié)合能力和催化效率方面也分別得到了不同程度的提高 (表4)，其中，突變體G128L、K269L和G128L/G393P對(duì)底物 (可溶性淀粉) 的親和力得到了明顯的提高，m值相比原酶分別降低了32.64%、29.17%和27.78%；同時(shí)，突變體G393P、K269L/G393P、G128L/G393P和G128L/K269L/G393P的max分別約是原酶的1.42、1.19、1.38、1.65倍；此外，突變體G128L、G393P、G128L/G393P和G128L/ K269L/G393P的cat/m分別約是原酶的1.72、1.83、2.40、2.00倍。

2.5 熱穩(wěn)定性的分子機(jī)制解析

為研究突變體熱穩(wěn)定性提高的分子機(jī)制，利用結(jié)構(gòu)建模對(duì)以上突變體結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行初步分析。通過對(duì)原始酶和突變體G128L蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型比較分析，可以看出當(dāng)原始蛋白中位于蛋白質(zhì)表面且柔性極強(qiáng)的G128 (圖4A) 突變?yōu)槭杷暂^好的L128 (圖4B) 之后，G122和T123分別與Y133形成了氫鍵 (圖4B)，氫鍵的總數(shù)目由原始的350個(gè)增加到352個(gè)。雖然蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)在突變前后沒有發(fā)生顯著變化，但是蛋白質(zhì)的局部微觀結(jié)構(gòu)可能由于Leu對(duì)Gly的替換而發(fā)生了改變，從而可以促使在其他氨基酸之間形成更多的氫鍵并增強(qiáng)了該無規(guī)則卷曲區(qū)域結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，突變后蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)整和其他氨基酸之間新的氫鍵的形成可能是突變體G128L比原酶具有更好的熱穩(wěn)定性的主要原因。

表4 ROAmy和突變體的比酶活以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖4 ROAmy (A) 及其突變體G128L (B) 的局部3D結(jié)構(gòu)模型

原酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模顯示K269可分別與F265和N270形成一個(gè)氫鍵 (圖5A)，當(dāng)K269突變?yōu)長(zhǎng)269之后，L269與N270之間則沒有氫鍵作用，同時(shí)在I276和L279之間形成新的氫鍵 (圖5B)。此外，原酶蛋白質(zhì)中位于無規(guī)則卷曲處的Y133僅與鄰近的G136和Y130形成氫鍵 (圖5C)，而在突變體K269L中Y133可以同時(shí)與鄰近的G136、Y130以及G122形成氫鍵 (圖5D)，因此使得氫鍵的總數(shù)目由原蛋白質(zhì)中的350個(gè)增加到突變體K269L中的351個(gè)。這種由一個(gè)氨基酸殘基突變而引起其他遠(yuǎn)距離氨基酸殘基之間相互作用發(fā)生改變的現(xiàn)象在嗜堿單胞菌堿性α-淀粉酶的突變過程中也發(fā)現(xiàn)過[22]。有趣的是，G128L和K269L兩個(gè)突變體中都在Y133和G122之間形成了新的氫鍵作用。由圖5B可知L269位于該α-螺旋結(jié)構(gòu)的外側(cè)，而Leu屬于疏水性氨基酸且含有Leu的側(cè)鏈更傾向于包埋在蛋白質(zhì)的內(nèi)部從而使該局部結(jié)構(gòu)更為緊密和穩(wěn)定[23]。由此推測(cè)，疏水性氨基酸 (Leu) 對(duì)局部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用以及由于微觀結(jié)構(gòu)改變而形成的更多的氫鍵作用可能是突變體K269L具有較高熱穩(wěn)定性的主要原因。

此外，在ROAmy中，G393位于該酶Domain C的一段柔性較強(qiáng)的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)角區(qū)域內(nèi) (如圖1和圖6A所示)，而Gly作為柔性最強(qiáng)的氨基酸出現(xiàn)在柔性又相對(duì)較強(qiáng)的β-折疊結(jié)構(gòu)中可能使得蛋白質(zhì)處于一種易于變化的不穩(wěn)定狀態(tài)。同時(shí)，B-factor值的計(jì)算結(jié)果亦顯示G393是ROAmy中最不穩(wěn)定的一個(gè)氨基酸。當(dāng)將ROAmy中393位的Gly突變?yōu)镻ro之后，原酶中Q392與N374之間的氫鍵 (圖6A) 消失，而在突變體G393P中重新于Q392和Y390之間形成了氫鍵。與原酶相比，雖然突變體G393P的氫鍵數(shù)目沒有發(fā)生變化，但該突變體的熱失活半衰期卻是原酶的5.20倍，是3個(gè)單突變體中最穩(wěn)定的一個(gè)。通過氨基酸結(jié)構(gòu)分析可知Pro由于自身的吡咯烷環(huán)結(jié)構(gòu)而具有較小的空間構(gòu)象自由度，因此Pro屬于一種剛性氨基酸并可能增強(qiáng)其所在區(qū)域結(jié)構(gòu)的剛性。在氫鍵數(shù)目沒有變化的情況下，這種在柔性結(jié)構(gòu)中利用剛性氨基酸 (Pro) 替代柔性氨基酸 (Gly) 而提高蛋白質(zhì)局部區(qū)域剛性的現(xiàn)象，可能是突變體G393P熱穩(wěn)定性得到顯著增強(qiáng)的主要原因之一。

圖5 ROAmy (A, C) 及其突變體K269L (B, D)的局部3D結(jié)構(gòu)模型

圖6 ROAmy (A) 及其突變體G393P (B) 的局部3D結(jié)構(gòu)模型

3 討論

有關(guān)α-淀粉酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與酶的熱穩(wěn)定性、pH耐受性或鹽濃度耐受性等理化性質(zhì)之間的關(guān)系的研究絕大部分都集中在細(xì)菌α-淀粉酶領(lǐng)域[24-26]，而對(duì)真菌α-淀粉酶的相關(guān)研究則鮮有報(bào)道。目前已知米曲霉α-淀粉酶 (Taka-amylase) 中的Asp206、Glu230和Asp297是該酶的核心催化位點(diǎn)[21]，同時(shí)上述3個(gè)氨基酸殘基也是α-淀粉酶家族共有的主要催化位點(diǎn)[27]，但是真菌α-淀粉酶中其他絕大部分氨基酸殘基的功能均是未知的。基于此，在沒有任何已知、可參考的數(shù)據(jù)前提下，本研究為了快速、有效地提升ROAmy的熱穩(wěn)定性，在設(shè)計(jì)中結(jié)合了B-factor值運(yùn)算和分子動(dòng)力學(xué)模擬兩種優(yōu)化設(shè)計(jì)方法并分別對(duì)ROAmy中B-factor值較高的前3個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行了突變。結(jié)果顯示，3個(gè)單突變體和4個(gè)組合突變體的熱穩(wěn)性均得到了不同程度的提高，其中單突變體G393P和組合突變體G128L/K269L/G393P的1/2分別是ROAmy的5.20倍和5.63倍。然而，組合突變體K269L/ G393P和G128L/G393P的1/2則小于單突變體G393P的1/2，并沒有表現(xiàn)出一些研究在組合突變體中發(fā)現(xiàn)的累積效應(yīng)或協(xié)同效果[22,28]，可能是由于組合突變體并不是嚴(yán)格意義上單突變體效應(yīng)的疊加且突變體與突變體之間也存在一定的拮抗效應(yīng)[29]。

影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素主要有氫鍵、鹽鍵、疏水相互作用和二硫鍵等，且不同類型的蛋白質(zhì)具有不同的與其熱穩(wěn)定性相關(guān)的影響因素[30]，如在葡聚糖內(nèi)切酶CelA的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲處等構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)域引入脯氨酸后可以顯著增強(qiáng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[31]，在α-淀粉酶催化區(qū)域中引入氫鍵和鹽鍵可提高酶蛋白質(zhì)在低pH下的穩(wěn)定性和催化效率[32]。通過比較ROAmy及其單突變體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的差異，發(fā)現(xiàn)氫鍵和脯氨酸的引入可能是突變體熱穩(wěn)定性得到提高的主要因素。本文中所采用的設(shè)計(jì)方法和所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)其他真菌α-淀粉酶或工業(yè)用酶的熱穩(wěn)定性定向進(jìn)化研究可能具有一定的參考價(jià)值。

[1] Hua HF, Luo HY, Bai YG, et al. A thermostable glucoamylase fromsp. MEY-1 with stability over a broad pH range and significant starch hydrolysis capacity. PLoS ONE, 2014, 9(11): e0113581.

[2] Li S, Zuo ZR, Niu DD, et al. Gene cloning, heterologous expression, and characterization of a high maltose-producing α-amylase of. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 164(5): 581–592.

[3] Zeng J, Guo JJ, Yuan L, et al. Optimization of the thermal activity and stability of hyperthermophilic α-amylase ApkA. Biotechnol Bull, 2017, 33(8): 192–198 (in Chinese). 曾靜, 郭建軍, 袁林, 等. 極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性的優(yōu)化研究. 生物技術(shù)通報(bào), 2017, 33(8): 192–198.

[4] EI-Okki AAKEH, Gagaoua M, Bennamoun L, et al. Statistical optimization of thermostable α-amylase production by a newly isolatedstrain FSIS4using decommissioned dates. Waste Biomass Valori, 2017, 8(6): 2017–2027.

[5] Qian Y, Duan G. New acid-stable fungal α-amylase for maltose syrup production. Food Ferment Indust, 2008, 34(2): 87–89 (in Chinese). 錢瑩, 段剛. 新型耐酸真菌淀粉酶在麥芽糖生產(chǎn)上的應(yīng)用. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(2): 87–89.

[6] Shen W, Lin LZ, Huang WW, et al. Heterologous expression of an acid-resistant fungal α-amylase and characterization of its recombinant enzyme. Food Ferment Indust, 2013, 39(8): 1–6 (in Chinese). 沈微, 林麗珍, 黃雯雯, 等. 一種酸性真菌α-淀粉酶的異源表達(dá)與重組酶性質(zhì). 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(8): 1–6.

[7] Li S, Wang ZX. Progress in research of fungal α-amylase. Biotechnol Bull, 2011, 224(3): 66–71 (in Chinese). 李松, 王正祥. 真菌α-淀粉酶的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2011, 224(3): 66–71.

[8] Reetz MT, Carballeira JD, Vogel A. Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability. Angew Chem Int Ed, 2006, 45(46): 7745–7751.

[9] Pang YP. Use of multiple picosecond high-mass molecular dynamics simulations to predict crystallographic B-factors of folded globular proteins. Heliyon, 2016, 2(9): e00161.

[10] Jochens H, Aerts D, Bornscheuer UT. Thermostabilization of an esterase by alignment-guided focussed directed evolution. Protein Eng Des Select, 2010, 23(12): 903–909.

[11] Duan XG, Chen S, Ai YX, et al. Enhancing the thermostability ofsucrose isomerase using B-factor-directed mutagenesis. PLoS ONE, 2016, 11(2): e0149208.

[12] Zhang JH, Lin Y, Sun YF, et al. High-throughput screening of B factor saturation mutatedLipase thermostability based on synthetic reaction. Enzyme Microb Technol, 2012, 50(6/7): 325–330.

[13] Liu XM, Zhang PP, Hu S, et al. Semi-rational molecular engineering to improve thermostability of cytochrome P450 BM-3. J Chem Eng Chin Univ, 2015, 29(5): 1138–1144 (in Chinese). 劉曉萌, 張彭湃, 胡升, 等. 細(xì)胞色素P450 BM-3熱穩(wěn)定性的半理性改造. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2015, 29(5): 1138–1144.

[14] Chen ZG, Fu Y, Xu WB. Insight into thermal stability of CGTase active site region by molecular dynamics simulation. Comput Appl Chem, 2013, 30(9): 967–972 (in Chinese). 陳志國(guó), 傅毅, 須文波. 分子動(dòng)力學(xué)模擬研究CGTase酶活性區(qū)域的熱穩(wěn)定性. 計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué), 2013, 30(9): 967–972.

[15] Huang J, Xie DF, Feng Y. Engineering thermostable (R)-selective amine transaminase fromthrough in silico design employing B-factor and folding free energy calculations. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 483(1): 397–402.

[16] Li Z, Duan XG, Chen S, et al. Improving the reversibility of thermal denaturation and catalytic efficiency ofα-amylase through stabilizing a long loop in domain B. PLoS ONE, 2017, 12(3): e0173187.

[17] Reetz MT, Carballeira JD. Iterative saturation mutagenesis(ISM) for rapid directed evolution of function enzymes. Nat Protoc, 2007, 2(4): 891–903.

[18] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248–254.

[19] Xiao ZZ, Reginald S, Adrian T. A quantitative starch-iodine method for measuring alpha-amylase and glucoamylase activities. Anal Biochem, 2006, 351(1): 146–148.

[20] ó’Fágáin C. Enzyme stabilization-recent experimental progress. Enzyme Microb Technol, 2003, 33(2/3): 137–149.

[21] Matsuura Y, Kusunoki M, Harada W, et al. Structure and possible catalytic residues of Taka-amylase A. J Biotechnol, 1984, 95(3): 697–702.

[22] Deng ZM, Yang HQ, Li JH, et al. Structure-based engineering of alkaline α-amylase from alkaliphilicfor improved thermostability. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(9): 3997–4007.

[23] Yang J, Li LZ, Xiao YZ, et al. Identification and thermoadaptation engineering of thermostability conferring residue of deep sea bacterial α-amylase AMY121. J Mol Catal B-Enzym, 2016, 126: 56–63.

[24] Singh S, Guruprasad L. Structure and sequence based analysis of alpha-amylase evolution. Protein Peptide Lett, 2014, 21(9): 948–956.

[25] Deng ZM, Yang HQ, Shin HD, et al. Structure-based rational design and introduction of arginines on the surface of an alkaline α-amylase fromfor improved thermostability. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(21): 8937–8945.

[26] Saxena RK, Dutt K, Agarwal L, et al. A highly thermostable and alkaline amylase from asp. PN5. Bioresource Technol, 2007, 98(2): 260–265.

[27] Sharma A, Satyanarayana T. Structural and biochemical features of acidic α-amylase of. Int J Biol Macromol, 2013, 61: 416–423.

[28] Li Z, Duan XG, Wu J. Improving the thermostability and enhancing the Ca2+binding of the maltohexaose-forming α-amylase from. J Biotechnol, 2016, 222: 65–72.

[29] Wen S, Tan TW, Zhao HM. Improving the thermostability of lipase Lip2 from. J Biotechnol, 2012, 164(2): 248–253.

[30] Yi Y, Wei YD, Deng C, et al. Research progress of amino acid residues in the protein thermal stability mechanism. J Guangxi Univ Sci Technol, 2015, 26(4): 1–5 (in Chinese). 易弋, 韋陽(yáng)道, 鄧春, 等. 氨基酸殘基在蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性機(jī)制中的研究進(jìn)展. 廣西科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 26(4): 1–5.

[31] Yi ZL, Pei XQ, Wu ZL. Introduction of glycine and proline residues onto protein surface increases the thermostability of endoglucanase CelA from. Bioresource Technol, 2011, 102(3): 3636–3638.

[32] Yang HQ, Liu L, Shin HD, et al. Structure-based engineering of histidine residues in the catalytic domain of α-amylase fromfor improved protein stability and catalytic efficiency under acidic conditions. J Biotechnol, 2013, 164(1): 59–66.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Improving the thermostability of α-amylase fromby rational design

Qian Yang, Bin Tang, and Song Li

School of Biological and Chemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, Anhui, China

Fungal α-amylases are widely used in the production of maltose syrup, while additional production costs may be required in the syrup production process due to the loss of enzyme activity, because of the poor thermostability exhibited in this type of enzyme. After deeply studying the importance of thermostability of fungal α-amylases applied in industrial production, with attempt to improve the thermostability ofα-amylase (ROAmy), single-point mutations and combined mutations that based on analysis of B-factor values and molecular dynamics simulations were carried out for amino acid residues G128, K269 and G393 of ROAmy by overlapping PCR. The results showed that all the 7 mutants obtained presented better thermostability than the wild-type enzyme, and the best mutant was G128L/K269L/G393P which showed a 5.63-fold increase in half-life at 55 ℃ compared with the wild-type enzyme. Meanwhile, its optimum temperature increased from 50 ℃ to 65 ℃, the maximum reaction rate (max) and catalytic efficiency (cat/m) increased by 65.38% and 99.86%. By comparing and analyzing the protein structure and function between the mutants and the wild-type enzyme, it was found that the increase of the number of hydrogen bonds or the introduction of proline in special position may be the main reasons for the improved thermostability that found in the mutants.

fungal α-amylase, B-factor, site-directed mutagenesis, thermostability, molecular dynamics simulation

December 12, 2017;

January 25, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31401630), Natural Science Foundation for the Youth of Anhui Province (No. 1708085QC63).

10.13345/j.cjb.170492

BinTang . Tel: +86-553-2871254; E-mail: tangbin@ahpu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 (No. 31401630)，安徽省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 (No. 1708085QC63) 資助。