大數(shù)據(jù)時(shí)代雜合酶的設(shè)計(jì)及其新趨勢

張群，吳秀蕓，蔣緒愷，趙越，王祿山

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大數(shù)據(jù)時(shí)代雜合酶的設(shè)計(jì)及其新趨勢

張群，吳秀蕓，蔣緒愷，趙越，王祿山

山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

酶分子的高效性和穩(wěn)定性是工業(yè)廣泛應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)。利用分子生物學(xué)技術(shù)可以將不同酶分子通過串聯(lián)、插入、翻譯后融合等方式構(gòu)建成符合工業(yè)需求的雜合酶，但應(yīng)用中多結(jié)構(gòu)域雜合酶在表達(dá)量與酶活等方面仍存在弊端，而基于特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的多功能設(shè)計(jì)成為新趨勢。高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使得生物學(xué)家正面臨著爆炸式增長的大數(shù)據(jù)集。近年來“蛋白質(zhì)功能區(qū)”概念的提出，拓寬了人們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能組織層次的認(rèn)知，功能區(qū)殘基聚簇的協(xié)同演化可導(dǎo)致同一家族不同蛋白質(zhì)功能的差異。基于海量大數(shù)據(jù)分析可以快速定位特定功能區(qū)以及協(xié)同進(jìn)化的關(guān)鍵位點(diǎn)，再利用合成生物學(xué)技術(shù)就可實(shí)現(xiàn)多種功能殘基在同一蛋白質(zhì)中的精準(zhǔn)嫁接，完成天然酶分子的再設(shè)計(jì)。這將是雜合酶技術(shù)發(fā)展的新階段，也會(huì)成為生物大數(shù)據(jù)時(shí)代下蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的新趨勢。

雜合酶，功能區(qū)，生物大數(shù)據(jù)，合成生物學(xué)技術(shù)，蛋白質(zhì)工程

酶制劑是工業(yè)生物技術(shù)快速發(fā)展的基石，早在20世紀(jì)初期，生物催化在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用已初見端倪[1]。由于工業(yè)應(yīng)用過程中酶分子的分離純化、穩(wěn)定性等因素影響，行業(yè)應(yīng)用成本較高，因而推廣應(yīng)用范圍有限。直至20世紀(jì)90年代隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以生物催化為核心的工業(yè)生物技術(shù)才取得了革命性的飛躍。然而酶制劑高效性與穩(wěn)定性仍是行業(yè)應(yīng)用的限制瓶頸，因而設(shè)計(jì)或改造形成高效穩(wěn)定的酶制劑仍是工業(yè)生物技術(shù)時(shí)代需要攻克的關(guān)鍵科學(xué)問題[2–3]。

1 功能酶分子的篩選與蛋白質(zhì)工程

工業(yè)生物技術(shù)作為21世紀(jì)新技術(shù)之一，對解決人類所面臨的食品、資源和環(huán)境等問題起到越來越重要的作用。獲得耐高溫、高鹽、酸堿的優(yōu)良酶制劑是工業(yè)生物技術(shù)的關(guān)鍵，人們常通過極端微生物或宏基因組學(xué)篩選獲得相關(guān)酶類 (圖1A)。盡管目前從自然界篩選了大量新型酶分子，但仍不能滿足工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用中的迫切需求[4]。為了克服天然酶分子在工業(yè)應(yīng)用中的固有缺陷，1983年Ulmer提出了蛋白質(zhì)工程 (Protein engineering) 的概念，即利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的工程化改造[5]。蛋白質(zhì)工程可設(shè)計(jì)出符合工業(yè)應(yīng)用的酶分子，在一定程度上加速酶分子的進(jìn)化歷程[6]。自提出以來，該技術(shù)先后經(jīng)過了定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)以及理性設(shè)計(jì)3個(gè)發(fā)展階段 (圖1B–D)。

定向進(jìn)化模擬自然進(jìn)化過程，無需了解蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制，通過隨機(jī)突變和定向篩選可獲得功能改善的酶分子。由于蛋白質(zhì)序列空間 (Sequence space) 巨大，因而建立靈敏的高通 量篩選方法是決定該策略成功與否的前提[7-8]。半理性設(shè)計(jì)可將功能變化定位至一個(gè)或幾個(gè)“熱點(diǎn)”殘基的突變，進(jìn)而改變酶分子的相應(yīng)功能[9]。然而從功能保守的蛋白質(zhì)家族 (一般序列一致性大于30%就可以歸為一個(gè)蛋白質(zhì)家族) 來看，長期的演化過程導(dǎo)致序列間相似性相對較低，但酶分子功能并沒有發(fā)生明顯改變，這說明半理性設(shè)計(jì)在實(shí)際應(yīng)用中存在低效性問題[10-11]。伴隨新一代測序技術(shù)，生物大分子序列和結(jié)構(gòu)信息的快速增長，相關(guān)數(shù)據(jù)庫也愈發(fā)豐富和完善，建立全新的大數(shù)據(jù)分析與挖掘技術(shù)，可指導(dǎo)蛋白質(zhì)工程走向更加理性的新階段[12]。

2 雜合酶及其構(gòu)建的分子生物學(xué)技術(shù)

根據(jù)Nixon所述，雜合酶 (Hybrid enzyme) 是指將兩個(gè)或多個(gè)不同酶分子的結(jié)構(gòu)元件或者功能結(jié)構(gòu)域整合到同一個(gè)分子中的新技術(shù)，其可以基于工業(yè)的需求而設(shè)計(jì)相應(yīng)酶類，因而得到工業(yè)生物技術(shù)行業(yè)的高度關(guān)注[14]。隨著早期分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們可以利用重組DNA技術(shù)或者翻譯后修飾方法構(gòu)建具有應(yīng)用價(jià)值的雜合酶分子，這包括基因水平的雜合與蛋白水平的直接融合等 (圖2)，早期構(gòu)建方式主要分為功能結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)融合、插入融合和翻譯后融合等形式[15]。

由于結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)進(jìn)化的功能單元，多結(jié)構(gòu)域的雜合酶往往比單結(jié)構(gòu)域的酶分子具有更穩(wěn)定的性質(zhì)和更多樣的功能，因而有利于降低酶制劑的生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)工藝。例如Ye 等構(gòu)建了肝素酶、麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP) 以及熒光蛋白的三重雜合體，基于熒光蛋白的快速追蹤以及MBP易于分離的性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了肝素酶的生產(chǎn)、分離以及催化等過程的集成，從而降低了酶制劑的應(yīng)用成本和低分子量肝素的生產(chǎn)成本[16]。此外，雜合酶可應(yīng)用于代謝過程中的順序反應(yīng)，將不同功能結(jié)構(gòu)域的酶分子雜合在一起，形成臨近效應(yīng)，從而明顯提升酶分子的催化效率[17]。

圖1 酶分子的篩選和改造策略[13]

圖2 構(gòu)建雜合酶的傳統(tǒng)方法[15]

2.1 功能結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)融合

雜合酶的串聯(lián)融合是指將兩個(gè)或多個(gè)不同酶分子連接在一起的融合方式，選擇理化性質(zhì) (最適溫度、pH等) 兼容的功能結(jié)構(gòu)域可以明顯提升雜合酶構(gòu)建的成功率，而結(jié)構(gòu)域的融合次序也是雜合酶可否構(gòu)建成功的關(guān)鍵因素[18]。串聯(lián)融合技術(shù)通?？梢灾苯哟?lián)融合，即一個(gè)酶的N端與另一酶的C端直接融合。Lu等將一個(gè)來自解淀粉芽孢桿菌的葡聚糖酶與來自枯草芽孢桿菌的木聚糖酶直接融合，所得雜合酶的葡聚糖酶活提高了 3倍，而木聚糖酶活降低了31%[19]。當(dāng)所融合的N端或C端具有重要功能，或者各結(jié)構(gòu)域距離太近而不能避免空間位阻時(shí)，會(huì)導(dǎo)致新的雜合酶分子發(fā)生錯(cuò)誤折疊、表達(dá)量偏低或者活性受損等問題[20-21]。解決此類難題的有效方式是引入連接肽(Linker)，其可以維持單個(gè)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象延伸性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，改善蛋白質(zhì)表達(dá)水平和生物活性[22]。

如何選擇或設(shè)計(jì)連接肽是一個(gè)值得深入研究的領(lǐng)域。研究者已經(jīng)設(shè)計(jì)出多種人工連接肽用于雜合酶分子的構(gòu)建，現(xiàn)將其分成3種類型：柔性型、剛性型和可斷裂型，表1總結(jié)了各種類型連接肽的特征與功能。目前已經(jīng)有很多連接肽實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用，如Kim等利用柔性型連接肽 (GGGGS)2實(shí)現(xiàn)了纖維素酶Cel5B和木聚糖酶Xyl10g的融合，所得雜合酶可更有效地降解稻草、秸稈等生物質(zhì) (圖3A)[23]。Chen等利用二硫蘇糖醇 (DTT) 可對二硫鍵的還原斷裂能力，從而設(shè)計(jì)了一種可斷裂連接肽，實(shí)現(xiàn)了粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF) 與轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Tf) 的體內(nèi)激活(圖3B)[24]。

2.2 功能結(jié)構(gòu)域的插入融合

多功能酶分子常將不同功能的結(jié)構(gòu)域按一定次序排列在同一多肽鏈上，然而自然界中仍有9%的多功能酶分子存在插入結(jié)構(gòu)域現(xiàn)象，即一個(gè)結(jié)構(gòu)域插入另一個(gè)結(jié)構(gòu)域之中[32]。因此，將一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域插入到宿主結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建雜合酶也是一種可行策略，它通常可形成抗蛋白酶水解的剛性結(jié)構(gòu)[33-34]。

插入融合技術(shù)需要兩個(gè)先決條件。首先，為了降低插入融合對插入結(jié)構(gòu)域柔性構(gòu)象的破壞，插入結(jié)構(gòu)域最末端兩殘基的Cα原子距離要在5 ?左右，且大小要小于宿主結(jié)構(gòu)域[35]；其次，該類宿主結(jié)構(gòu)域可適應(yīng)新結(jié)構(gòu)域的插入，即兩結(jié)構(gòu)域可互相兼容[36]。PDB數(shù)據(jù)庫中約50%的蛋白質(zhì)含有臨近的末端，滿足插入結(jié)構(gòu)域的條件[37]。然而宿主結(jié)構(gòu)域不易尋找到插入位點(diǎn)，這使得該策略要比串聯(lián)融合操作過程繁瑣。人們常選擇宿主結(jié)構(gòu)域表面的loop或轉(zhuǎn)角位置作為結(jié)構(gòu)域插入位點(diǎn)，這可消除結(jié)構(gòu)域間位阻沖突，但可能會(huì)破壞宿主結(jié)構(gòu)域原有的相互作用網(wǎng)絡(luò)，使得雜合酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低[15,38]。目前，插入融合技術(shù)已經(jīng)有多個(gè)成功案例，如Ribeiro等將木聚糖酶XynA插入到大腸桿菌木糖結(jié)合蛋白XBP中，篩選到兩種活性都提高20%的雜合酶 (圖3C)[39]。

表1 各種類型連接肽的匯總

This table is redrawn from Chen et al[22].

2.3 功能結(jié)構(gòu)域的翻譯后融合

多結(jié)構(gòu)域的雜合酶在異源表達(dá)過程中常形成包涵體，導(dǎo)致雜合酶表達(dá)量偏低或不能正確折疊，這限制了雜合酶技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此人們又開發(fā)了翻譯后蛋白質(zhì)水平上的結(jié)構(gòu)域融合技術(shù)[40]。翻譯后蛋白質(zhì)水平的融合技術(shù)主要包括化學(xué)交聯(lián)法和酶聯(lián)法?；瘜W(xué)交聯(lián)法可高效構(gòu)建雜合酶分子，但化學(xué)試劑不具有特異性，常常會(huì)導(dǎo)致雜合酶分子發(fā)生不正確聚集[41]。酶聯(lián)法是構(gòu)建雜合酶更溫和更常用的方法，該技術(shù)主要用轉(zhuǎn)肽酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 (TGase)以及過氧化物酶等完成相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的雜合[42]。Hirakawa等利用TGase構(gòu)建了一個(gè)單加氧酶細(xì)胞色素P450cam、假單孢氧還蛋白Pdx以及Pdx還原酶Pdr的三元雜合酶，實(shí)現(xiàn)了分子內(nèi)電子的快速轉(zhuǎn)移，使得電子傳遞效率與催化效率較3種游離蛋白質(zhì)混合物有了明顯提升 (圖3D)[43]。

圖3 構(gòu)建雜合酶的成功案例[15,23,39,43]

3 生物大數(shù)據(jù)時(shí)代雜合酶的分子設(shè)計(jì)

3.1 高通量測序技術(shù)與生物大數(shù)據(jù)時(shí)代

進(jìn)入新世紀(jì)，新一代高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，測序成本急劇降低，使得高通量測序成為通用技術(shù)；而Miseq等測序技術(shù)測序通量可高達(dá) 1 Gb/run，這就使得生物序列數(shù)據(jù)爆炸式增長；截止到2017年9月，NCBI數(shù)據(jù)庫中核酸序列已有約2.45億條[46-47]。蛋白質(zhì)序列由基因序列數(shù)據(jù)翻譯而來，去除冗余序列后，Uniprot數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)序列至2017年9月已有9 000萬余條，但轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)的只占1.22%，蛋白質(zhì)水平證實(shí)更低，僅有0.15%[48]。同時(shí)，近幾年冷凍電鏡等結(jié)構(gòu)測定技術(shù)的快速發(fā)展也使得生物大分子的結(jié)構(gòu)信息不斷增多，2016年 2月23日PDB數(shù)據(jù)庫就已實(shí)現(xiàn)10億原子的存檔[49]。因此現(xiàn)代生物學(xué)已經(jīng)進(jìn)入到大數(shù)據(jù)時(shí)代[50]，現(xiàn)在生物工作者所面臨的主要科學(xué)問題可能不再是序列、結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)太少，而是如何對生物大數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析與挖掘、促進(jìn)蛋白質(zhì)功能的準(zhǔn)確預(yù)測與分析、以及應(yīng)用于酶分子理性設(shè)計(jì)與改造等方面[51]。

不同來源的生物大數(shù)據(jù)已按一定格式與要求存儲于相關(guān)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中，由于實(shí)驗(yàn)通量限制人們不可能逐條分析驗(yàn)證其生物學(xué)功能，因此必須建立相關(guān)算法及不同數(shù)據(jù)間的關(guān)聯(lián)，完成其功能準(zhǔn)確有效的注釋[52]。早在人類基因組草圖完成時(shí)，有人就利用同源性方法來預(yù)測基因及其功能，提出以蛋白序列一致性30%為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建蛋白質(zhì)家族 (Protein family)，利用同源模建方法來構(gòu)建結(jié)構(gòu)并分析預(yù)測功能[53]。至2017年3月蛋白質(zhì)家族的個(gè)數(shù)為1.6萬左右 (http://pfam.xfam. org/help)[54-55]，PDB數(shù)據(jù)庫中生物大分子結(jié)構(gòu)的數(shù)目也已經(jīng)超過13萬個(gè)[56]，現(xiàn)在每一蛋白質(zhì)家族基本都含有一個(gè)已測定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。由于同一家族具有相似的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，而不同蛋白質(zhì)處于不同的選擇壓力之下，因而具有不同的進(jìn)化速率[57-58]，所以分析同一家族內(nèi)特定結(jié)構(gòu)空間的約束與局部功能區(qū)的快速演化就可完成其功能的有效預(yù)測與分析，這就是“結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)(Structrual bioinformatics)”的研究策略[59]。

3.2 結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)的聚類分析與雜合酶的設(shè)計(jì)

由于海量生物大數(shù)據(jù)的持續(xù)增長，人們提出要根據(jù)序列相似性程度對蛋白質(zhì)家族進(jìn)行進(jìn)一步分析與更深層次的聚類，以對應(yīng)酶分子功能分類的不同層次，從而提高序列功能預(yù)測的準(zhǔn)確度[60]。現(xiàn)在CATH等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫已經(jīng)根據(jù)不同的序列一致性細(xì)化出不同的層次聚類 (序列一致性<35%為S層，<60%為O層，<95%為L層，100%為I層)[61]；CAZy數(shù)據(jù)庫也基于序列一致性>75%的標(biāo)準(zhǔn)提出了GH5家族新的“亞家族 (Subfamily)”分類系統(tǒng)，這為糖苷水解酶等進(jìn)一步功能分析預(yù)測以及功能基元 (Motif) 的確定奠定了基礎(chǔ)[62]。生物大數(shù)據(jù)的細(xì)化分類進(jìn)一步提升了序列結(jié)構(gòu)分析的效率與準(zhǔn)確率[63]，特別是基于亞家族等近源序列、結(jié)構(gòu)與功能的分析與其分子動(dòng)力學(xué)模擬，可明顯降低序列空間的搜索范圍與搜索強(qiáng)度[64-65]。

通過對同一聚類的蛋白質(zhì)家族或亞家族等成員進(jìn)行多結(jié)構(gòu)比對分析等，快速定位催化活性中心的活性架構(gòu) (Active archtechture)[64]；再對其進(jìn)行比較分子動(dòng)力學(xué)模擬 (MDs) 分析，認(rèn)識酶分子特定功能簇的分子動(dòng)態(tài)行為，定位功能簇內(nèi)殘基的相互作用網(wǎng)絡(luò)及其動(dòng)態(tài)學(xué)變化，分析如酶蛋白熱敏感區(qū)等的分子動(dòng)態(tài)性質(zhì)，從而可確定熱穩(wěn)定性等相關(guān)基元并進(jìn)行精準(zhǔn)嫁接[66-67](圖4A)。如Jiang等利用比較分子動(dòng)力學(xué)模擬方法對糖苷水解酶GH12家族5種酶分子的分子動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)該家族的熱敏感區(qū)主要位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的N末端，并且同一家族不同熱穩(wěn)定性的酶分子間存在明顯規(guī)律性變化，這也使得在GH12家族內(nèi)不同酶分子之間進(jìn)行熱敏感區(qū)的嫁接成為可能[66]。GH12家族結(jié)構(gòu)除N端區(qū)域?qū)崦舾型?，其催化活性架?gòu)的多個(gè)loop也是熱敏感區(qū)，且不同成員對熱擾動(dòng)的抵抗能力也是不同的，嗜熱酶的活性架構(gòu)loop與周圍殘基傾向于形成更多的相互作用網(wǎng)絡(luò)[68]。而基于同一蛋白質(zhì)家族或亞家族成員的比較分析，可以針對特定蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)表面嫁接 (Protein surface grafting) 等改造，從而完成生物大分子的理性設(shè)計(jì)。如Kapoor等將里氏木霉的中溫纖維素酶 (Cel12A) 的活性架構(gòu)殘基嫁接到海洋紅嗜熱鹽菌的嗜熱纖維素酶(Cel12A) 的活性架構(gòu)中，成功地獲得了一個(gè)適中溫活性的熱穩(wěn)定性雜合酶[69]。

除熱穩(wěn)定性外，耐鹽性和pH耐受性也是限制酶制劑應(yīng)用的重要因素。通過對蛋白質(zhì)家族內(nèi)不同酶分子表面帶電殘基的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)其與耐鹽性和pH耐受性密切相關(guān)，這不僅涉及分子內(nèi)殘基的相互作用，而且與溶劑分子也存在重要作用[70-71]。已有研究發(fā)現(xiàn)耐鹽酶結(jié)構(gòu)中α螺旋較少，無規(guī)卷曲偏多，而且分子表面分布有較多的負(fù)電殘基 (D/E) 和小側(cè)鏈的疏水殘基 (如G/A)[72-73]。由于分子表面較多D/E的存在，耐鹽酶分子對酸的耐受性明顯增強(qiáng)[74]。耐堿酶與耐酸酶明顯不同，其分子表面的D/E含量在進(jìn)化中逐漸降低，取而代之的是較多的正電殘基 (如R) 和中性親水殘基 (如N/Q)[75]。人們通過在GH11家族木聚糖酶XynJ的表面引入多個(gè)R殘基，成功提高了其耐堿性[76]。目前，通過結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析功能殘基突變前后的分子表面電勢 (VEs) 變化，可以指導(dǎo)表面帶電氨基酸殘基的精準(zhǔn)嫁接，這已成為構(gòu)建穩(wěn)定型雜合酶的全新策略[77](圖4B)。最近研究已有改造成功的案例，如Kiss等利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)方法，將牛碳酸酐酶Ⅱ表面的K、L、R、N、Q、V等殘基突變?yōu)镈、E，通過DNA合成技術(shù)構(gòu)建了4個(gè)雜合酶，并成功將其改造為耐鹽酶[78]。Woodiey等將植酸酶表面的R、K、Q等殘基突變?yōu)镈，使其在pH 2.8下的穩(wěn)定性提高了3.8倍[77]。

3.3 蛋白質(zhì)功能區(qū)的精準(zhǔn)嫁接與酶分子的再設(shè)計(jì)

蛋白質(zhì)功能的執(zhí)行常常是其空間結(jié)構(gòu)的一部分，由功能殘基聚簇 (Clusters of residues) 形成特定的局部結(jié)構(gòu)來行使特定功能。然而蛋白質(zhì)序列空間巨大，功能殘基聚簇的尋找無疑是大海撈針。由于功能基因在天然環(huán)境中經(jīng)億萬年進(jìn)化篩選，形成了具有功能的天然多樣性 (Natural diversity) 文庫，這是經(jīng)自然選擇后的文庫，較定向進(jìn)化產(chǎn)生的文庫要小的多[79]。因此基于高通量測序產(chǎn)生的天然多樣性文庫，研究特定功能殘基聚簇的形成途徑與策略將會(huì)找出“馴化突變 (Educated mutations)”，并利用這些突變再賦予天然活性位點(diǎn)以新功能[80]。特別是對多功能的蛋白質(zhì)家族，就可作為酶分子再設(shè)計(jì) (Enzyme redesign) 的重要起點(diǎn)。通過蛋白質(zhì)家族序列大數(shù)據(jù)的深入挖掘與分析，可快速定位相關(guān)殘基的功能聚簇并認(rèn)識其演化規(guī)律。如Reyndds等2009年提出蛋白質(zhì)功能區(qū) (Sectors) 的相關(guān)算法[81]，該算法通過蛋白質(zhì)家族內(nèi)上千條序列的統(tǒng)計(jì)分析，定位局部空間聚簇的多個(gè)功能區(qū)[82-84]。此外，研究發(fā)現(xiàn)功能區(qū)在整個(gè)蛋白質(zhì)家族中呈現(xiàn)明顯分化現(xiàn)象，可導(dǎo)致同一家族成員功能上的顯著差異[81]。

在序列大數(shù)據(jù)快速增長的背景下，Hopf于2012年提出了一種可全面分析單基因突變的統(tǒng)計(jì)耦合分析(Statistical coupling analysis，SCA)方法。通過該方法可在同源序列分析相關(guān)聚簇氨基酸殘基間的協(xié)同進(jìn)化，從而探究功能區(qū)內(nèi)氨基酸之間的關(guān)聯(lián)與其功能的關(guān)系。已有研究表明蛋白質(zhì)中大部分殘基幾乎都是獨(dú)立演化的，而約有20%的氨基酸可與協(xié)同進(jìn)化的氨基酸殘基形成連續(xù)相互作用的功能區(qū)[85]。由于序列大數(shù)據(jù)中包含豐富的蛋白質(zhì)功能約束及其進(jìn)化信息，因而可有效分析蛋白質(zhì)功能區(qū)殘基間的協(xié)同進(jìn)化，可以幫助確定參與配體結(jié)合的功能區(qū)、蛋白質(zhì)復(fù)合體形成功能區(qū)以及參與構(gòu)象調(diào)控的相關(guān)功能殘基及其組合，這對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子相互作用以及進(jìn)化動(dòng)力學(xué)等研究都具有重要意義[86-87]。目前已研究證實(shí)，以序列/結(jié)構(gòu)大數(shù)據(jù)為研究驅(qū)動(dòng)，不僅可估計(jì)三維結(jié)構(gòu)中聯(lián)系緊密的殘基及其組合[88-90]，還可將蛋白質(zhì)折疊預(yù)測提高至合理精確度[91-93]。此外，蛋白質(zhì)功能區(qū)氨基酸協(xié)同進(jìn)化的相關(guān)分析平臺與網(wǎng)站現(xiàn)已建立并可提供在線服務(wù)，如Evfold (http:// evfold.org/) 等，該網(wǎng)站采用最大熵法在線計(jì)算蛋白質(zhì)家族中協(xié)同進(jìn)化的相關(guān)氨基酸殘基與組合[94]。

伴隨大數(shù)據(jù)時(shí)代序列數(shù)據(jù)挖掘新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，功能區(qū)以及協(xié)同進(jìn)化的相關(guān)分析算法將進(jìn)一步簡化，對家族內(nèi)序列數(shù)目的要求也進(jìn)一步降低，這將使得功能區(qū)的設(shè)計(jì)與其嫁接更加快捷與便利[95]。如SCHEMA等針對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)優(yōu)化算法的推出，已成功應(yīng)用于雜合酶穩(wěn)定性的設(shè)計(jì)。基于該算法人們可在不影響蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的前提下，定位雜合體中可能被破壞的相互作用區(qū)域，從而篩選出受穩(wěn)定性影響最小的雜合酶[96]。這種以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的重組方案要比基于序列的DNA改組 (DNA shuffling) 更加高效，可有效避免基因重組過程中的結(jié)構(gòu)域坍塌[97]。此外，DNA合成技術(shù)迅速崛起，合成速度、精度、長度的提高以及合成成本的大幅度降低，使其逐漸取代了基因組DNA的提取與克隆等分子生物學(xué)技術(shù)，這促使蛋白質(zhì)工程發(fā)展到了全新的階段[7,98]。

因此，基于序列結(jié)構(gòu)等生物大數(shù)據(jù)的挖掘與分析，結(jié)合動(dòng)力學(xué)模擬分析蛋白質(zhì)整體與局域分子動(dòng)態(tài)學(xué)行為，通過進(jìn)化分析準(zhǔn)確定位家族或亞家族內(nèi)協(xié)同進(jìn)化的功能殘基聚簇及組合，構(gòu)建“小而精 (Small but smart) ”的雜合體文庫完成酶分子功能的精準(zhǔn)嫁接，這將會(huì)明顯提高雜合酶分子設(shè)計(jì)與改造的成功概率 (圖4C)，從而促進(jìn)酶分子功能再設(shè)計(jì)的快速發(fā)展[7]。

圖4 生物大數(shù)據(jù)時(shí)代雜合酶的設(shè)計(jì)策略[86]

4 展望

工業(yè)生物技術(shù)的迅猛發(fā)展為人類解決能源和環(huán)境等問題提供了前所未有的機(jī)遇，然而現(xiàn)代化工業(yè)生物技術(shù)是一個(gè)全新的應(yīng)用環(huán)境，所要求的條件明顯不同于自然環(huán)境，因此對酶制劑提出了更加嚴(yán)苛的要求。盡管近年來人們在構(gòu)建多結(jié)構(gòu)域的雜合酶中取得了顯著成效，但實(shí)際應(yīng)用中多結(jié)構(gòu)域雜合酶常得不到理想的表達(dá)量及相關(guān)活性，這一定程度上阻礙了雜合酶的工業(yè)應(yīng)用[99-100]。所 以為了滿足工業(yè)生物技術(shù)快速發(fā)展的迫切需求，就需要對所篩選的酶分子進(jìn)行系統(tǒng)的再設(shè)計(jì)與改造。伴隨后基因組時(shí)代的到來，測序通量迅速增加，結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)急劇膨脹，如何對生物大數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘與分析，為酶分子理性設(shè)計(jì)提供全新 思路與平臺技術(shù)是當(dāng)下生命科學(xué)亟待解決的關(guān)鍵問題。

生物大數(shù)據(jù)是連接人、機(jī)、物的三元紐帶，為生命科學(xué)在基因和蛋白質(zhì)層面的研究起到了關(guān)鍵的推進(jìn)作用[101]。其在為生命科學(xué)研究提供新方法論的同時(shí)，也不可避免地將我們置身于新的挑戰(zhàn)中。如：如何提高生物大數(shù)據(jù)分析的速度與準(zhǔn)確度[102]；如何確保軟件分析界面的可視化、易用性與普適性，如何有效建立不同大數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)等[103]。不過，現(xiàn)在生物大數(shù)據(jù)挖掘的新方法新技術(shù)已經(jīng)開始沖擊傳統(tǒng)的思維模式，其不斷的發(fā)展與提升將會(huì)促進(jìn)人們思維模式由“假設(shè)驅(qū)動(dòng)”向“數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)”轉(zhuǎn)變，因此將會(huì)給蛋白質(zhì)工程帶來新技術(shù)與新模式。

基于海量生物大數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析，提出全新的算法與分析平臺，提升大數(shù)據(jù)挖掘的速率、效率，構(gòu)建友好的人機(jī)對話界面，簡便快捷地進(jìn)行生物大分子的序列、結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)及功能的系統(tǒng)分析，快速定位結(jié)構(gòu)空間中的相關(guān)功能區(qū)及其協(xié)同進(jìn)化的功能殘基聚簇，指導(dǎo)酶分子的精準(zhǔn)嫁接，完成大數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)下酶分子的再設(shè)計(jì)，這將是雜合酶設(shè)計(jì)的新階段，也將是蛋白質(zhì)工程的新趨勢。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Trend of hybrid enzyme design in the big data era

Qun Zhang, Xiuyun Wu, Xukai Jiang, Yue Zhao, and Lushan Wang

The State Key Laboratory of Microbial Technology, College of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250100, Shandong, China

The high efficiency and stability of enzymes are the basis for industrial application. Hybrid enzyme suitable for industrial applications could be constructed by many molecular biology technologies including tandem fusion, domain insertion and post-translational protein conjugation. However, the low expression and activity of hybrid enzyme limit its application in industrial production, and multifunctional design of a specific protein domain has been becoming a new trend. With the advent of high-throughput sequencing, biologists are starting to wrestling with massive data sets. Besides, the concept of protein sectors and co-evolution provides novel insight into the relationship of protein structure and function. The residues–covariation of a protein sector displays preference, which imparts functional diversity to different enzymes in the same family. The covariation-residues in specific protein sectors can be located based on the analysis of massive data, and then these functional residues can be assembled in a new enzyme variant using the biotechnology of synthetic biology, thus completing the redesign of natural enzymes. This indicates a new stage of designing hybrid enzyme, as well as the new trend of protein design in the era of biological big data.

hybrid enzyme, sectors, biological big data, synthetic biology, protein engineering

December 21, 2017;

January 12, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31370111), Shandong Provincial Natural Science Foundation (No. ZR2013CM038), Shandong University Basic Research Business Special Funds (No. 2015YQ004).

Lushan Wang. Tel: +86-531-88366202; E-mail: lswang@sdu.edu.cn

10.13345/j.cjb.170504

國家自然科學(xué)基金 (No. 31370111)，山東省自然科學(xué)基金 (No. ZR2013CM038)，山東大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. 2015YQ004) 資助。

2018-05-23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180522.1335.001.html