定制酶分子機(jī)器/細(xì)胞工廠，引領(lǐng)生物制造產(chǎn)業(yè)未來(lái)——2017年第十一屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)杜邦-杰能科中國(guó)酶工程杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)獲得者特邀報(bào)告

姜水琴，魏東芝

?

魏東芝 二級(jí)教授，華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所所長(zhǎng)。學(xué)術(shù)兼職：生物化工國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科帶頭人，教育部生物技術(shù)與生物工程專業(yè)教指委副主任委員，中國(guó)微生物學(xué)會(huì)酶工程專業(yè)委員會(huì)副主任，上海生物工程學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)。榮譽(yù)稱號(hào)：全國(guó)優(yōu)秀科技工作者，教育部跨世紀(jì)優(yōu)秀人才，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才，中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”入選者，上海市領(lǐng)軍人才，上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人，上海市科技英才提名，上海市科技啟明星，山東省“泰山學(xué)者”，山東省“泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才”。從事酶學(xué)與生物催化研究30多年，在、、、、、、等期刊發(fā)表300余篇論文，他引超過(guò)6 500次，獲授權(quán)中國(guó)發(fā)明專利45項(xiàng)，實(shí)審國(guó)際專利3項(xiàng)，工業(yè)酶制劑生產(chǎn)、生物催化與轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)手性非天然氨基酸、甾體藥物中間體及多元醇衍生物等項(xiàng)目在12家企業(yè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化 (受益企業(yè)50多家)。曾獲國(guó)家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，上海市技術(shù)發(fā)明及科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)3項(xiàng)，第十五屆國(guó)際工業(yè)博覽會(huì)銅獎(jiǎng)1項(xiàng)，杜邦-杰能科中國(guó)酶工程杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)。

定制酶分子機(jī)器/細(xì)胞工廠，引領(lǐng)生物制造產(chǎn)業(yè)未來(lái)——2017年第十一屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)杜邦-杰能科中國(guó)酶工程杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)獲得者特邀報(bào)告

姜水琴，魏東芝

華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

工業(yè)酶制劑研發(fā)與應(yīng)用已經(jīng)滲透到各大工業(yè)領(lǐng)域，但中國(guó)作為用酶大國(guó)、產(chǎn)酶小國(guó)面臨重大挑戰(zhàn)，鑒于以化學(xué)催化為核心的基礎(chǔ)物質(zhì)加工業(yè)面臨資源、能源和環(huán)境三大危機(jī)，酶工程與生物催化已被列入許多國(guó)家的科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略，應(yīng)用高效、清潔的生物催化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)化學(xué)工業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)業(yè)升級(jí)的重要途徑之一。文中以2017年第十一屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)杜邦-杰能科中國(guó)酶工程杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)獲得者特邀報(bào)告為基礎(chǔ)整理編寫而成，從自主酶庫(kù)構(gòu)建、酶分子機(jī)器/細(xì)胞工廠創(chuàng)制及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等角度概述當(dāng)前酶工程與生物催化發(fā)展現(xiàn)狀及前景。

酶分子機(jī)器，細(xì)胞工廠，生物制造，產(chǎn)業(yè)未來(lái)，催化劑定制

傳統(tǒng)工業(yè)體系依賴化石資源，但化石資源儲(chǔ)存有限且不可再生，同時(shí)化石資源的工業(yè)化應(yīng)用引起了全球氣候變暖、大氣污染、海洋污染等嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。傳統(tǒng)工業(yè)體系面臨嚴(yán)重的環(huán)境危機(jī)、資源危機(jī)以及能源危機(jī)，如何減少或擺脫對(duì)化石資源的依賴、建立可持續(xù)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式引起全球關(guān)注和思考。工業(yè)生物技術(shù)清潔、可再生，被稱為白色生物技術(shù)，其能源和工業(yè)原料等不再完全依賴于化石能源，并有助于解決溫室氣體排放等環(huán)境問(wèn)題。工業(yè)生物技術(shù)的核心是酶與生物催化，因此，發(fā)展工業(yè)酶及生物催化與轉(zhuǎn)化技術(shù)，創(chuàng)建綠色生物制造工業(yè)體系已經(jīng)成為社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重大戰(zhàn)略方向。酶工程作為生物制造工業(yè)體系的核心受到學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的密切關(guān)注，近年來(lái)高通量測(cè)序和定向進(jìn)化技術(shù)、計(jì)算生物學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)步推動(dòng)了酶工程領(lǐng)域的迅速發(fā)展。文中以2017年第十一屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)“杜邦杰能科中國(guó)酶工程杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)”獲得者特邀報(bào)告為藍(lán)本，從自主酶庫(kù)構(gòu)建、酶分子機(jī)器/細(xì)胞工廠創(chuàng)制及產(chǎn)業(yè)應(yīng)用等方面概述了當(dāng)前酶工程與生物催化領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀及前景。

1 自主酶庫(kù)的構(gòu)建

現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展更加注重綠色可持續(xù)發(fā)展，酶作為催化劑因環(huán)境友好等特點(diǎn)長(zhǎng)期受到化學(xué)合成領(lǐng)域的關(guān)注[1-4]。為滿足化學(xué)合成對(duì)酶催化劑的需求,針對(duì)中國(guó)“用酶大國(guó)、產(chǎn)酶小國(guó)”的現(xiàn)實(shí)，作者團(tuán)隊(duì)堅(jiān)持“自主酶庫(kù)、自主應(yīng)用”原則，開(kāi)展了系統(tǒng)性的酶庫(kù)構(gòu)建工作。自然界大量的微生物酶基因難以培養(yǎng)捕獲，作者團(tuán)隊(duì)采用宏基因組技術(shù)和基因組步行等技術(shù)，快速、大量捕獲不可培養(yǎng)微生物酶基因，采用生物信息學(xué)手段分析了大量生物數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)掘了特定功能的酶，構(gòu)建了不同來(lái)源、不同性質(zhì)、可批量生產(chǎn)、數(shù)量高達(dá)2 000多種的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的酶庫(kù)，其中包含氧化還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶等[5-17]，為工業(yè)酶制劑的產(chǎn)業(yè)化及其應(yīng)用提供了保障。

2 生物催化劑的定制

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，品種繁多的化學(xué)品、化妝品、醫(yī)藥中間體等需求快速增加，來(lái)自自然界的酶通常存在底物譜窄、手性選擇性不高、催化效率低、產(chǎn)物不單一、輔酶依賴性強(qiáng)等性能缺陷，難以滿足生產(chǎn)需求[18-20]。新技術(shù)、新工具的研究和開(kāi)發(fā)已成為酶工程發(fā)展的前沿課題，在此基礎(chǔ)上定制高端酶制劑、酶分子機(jī)器及細(xì)胞工廠，開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源向高附加值生物基材料、化學(xué)品、生物能源等工業(yè)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化，已成為酶工程發(fā)展的必然趨勢(shì)。

2.1 酶分子定制

作者團(tuán)隊(duì)著眼學(xué)術(shù)前沿，針對(duì)酶工程領(lǐng)域研究瓶頸，開(kāi)發(fā)了一系列用于酶分子定制的新技術(shù)和新工具，以推動(dòng)酶工程領(lǐng)域的快速發(fā)展。

酶學(xué)研究中的重要工作之一是發(fā)現(xiàn)新酶并鑒定其底物譜。但由于酶的底物選擇性實(shí)驗(yàn)需要合成大量底物并完成大量催化反應(yīng)以及后續(xù)產(chǎn)物分離與分析，耗時(shí)費(fèi)力。作者團(tuán)隊(duì)基于酶催化反應(yīng)的一般催化規(guī)律，設(shè)計(jì)了一套基于分子對(duì)接的底物篩選系統(tǒng)，將不可量化評(píng)價(jià)的構(gòu)象條件轉(zhuǎn)換成可以量化評(píng)價(jià)的打分函數(shù)，采用C++語(yǔ)言等完成了自動(dòng)分析軟件的編寫，可以快速實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的潛在底物的預(yù)測(cè)。以CALB為對(duì)象，對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的100多個(gè)潛在底物進(jìn)行測(cè)試，正確率超過(guò)92%[21]。

從已有小分子數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)全新的有價(jià)值的底物的過(guò)程存在一個(gè)瓶頸，即化合物數(shù)據(jù)庫(kù)的限制。目前已知的任何一種構(gòu)建化合物數(shù)據(jù)庫(kù)的方法均不能把已知的和潛在的所有化合物全部包含其中，即使有些化合物可以簡(jiǎn)單合成，也可能并沒(méi)有被涵蓋。若能將這些數(shù)據(jù)也囊括在考察范圍內(nèi)，并給出一系列可能的新底物，那么對(duì)于酶的催化潛力的深度挖掘?qū)⒑苡袃r(jià)值。作者團(tuán)隊(duì)從這個(gè)角度出發(fā)，放棄原有的基于數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選思路，從酶的結(jié)構(gòu)出發(fā)構(gòu)建合適的底物分子，開(kāi)發(fā)、建立了一套全新的底物分子從頭設(shè)計(jì)軟件(substrate design)。該方法基于已知的酶與底物的催化機(jī)理和結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用蒙塔卡洛算法、分子力場(chǎng)、組合化學(xué)等技術(shù)，進(jìn)行分子片段的虛擬生長(zhǎng)，搜尋酶的潛在底物分子。該項(xiàng)工作采用了被廣泛接受的分子力學(xué)建模方法，通過(guò)結(jié)合理論計(jì)算得出的關(guān)鍵催化信息，建立了一種快速、高通量的預(yù)測(cè)新型底物分子的方法。軟件采用Python語(yǔ)言編寫，整合第三方開(kāi)源代碼，通過(guò)MPI方式實(shí)現(xiàn)了高效的大規(guī)模并行計(jì)算。該方法被用于3個(gè)來(lái)源與功能完全不同的醛酮還原酶、腈水解酶和脂肪酶，均表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性和可靠性。該軟件將推進(jìn)酶學(xué)研究中計(jì)算模擬與實(shí)驗(yàn)的良好結(jié)合，為酶及其催化性質(zhì)的認(rèn)知帶來(lái)更多的可能[22-23]。

隨著高通量測(cè)序和定向進(jìn)化技術(shù)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計(jì)算生物學(xué)的發(fā)展，采用定向進(jìn)化技術(shù)、半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)等手段，依據(jù)產(chǎn)業(yè)化需求對(duì)酶分子進(jìn)行定制已是酶工程發(fā)展的必經(jīng)之路[3,24-27]。作者團(tuán)隊(duì)依據(jù)生物制造產(chǎn)業(yè)界提出的技術(shù)難題和酶制劑需求，采用上述手段實(shí)現(xiàn)了多個(gè)酶催化劑的結(jié)構(gòu)與機(jī)制解析及設(shè)計(jì)改造工作，積累了扎實(shí)的手性選擇性改造與調(diào)控技術(shù)，定制了多個(gè)具備高手性選擇性、高催化活力的新型酶催化劑。

作者團(tuán)隊(duì)挖掘獲得了一株芳基乙腈類腈水解酶NIT9，在扁桃腈水解過(guò)程中對(duì)S構(gòu)型表現(xiàn)出較高選擇性 (值為49.5%，這已是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平)，但與工業(yè)應(yīng)用需求仍有很大差距。通過(guò)隨機(jī)突變結(jié)合定點(diǎn)突變、飽和突變及組合突變等技術(shù)將其S構(gòu)型選擇性提高至91.7%；更令人興奮的是，通過(guò)揭示酶催化中心半胱氨酸殘基的巰基與底物氰基碳原子之間的距離影響了酶的立體選擇性，成功地將該酶的對(duì)映體選擇性反轉(zhuǎn)為R構(gòu)型 (值為90.9%)，實(shí)現(xiàn)了腈水解酶手性選擇性的雙向切換。在獲得高效催化扁桃腈高選擇性生產(chǎn)R-扁桃酸獲得產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)上，作者期望進(jìn)一步定制可催化鹵代芳香腈類化合物的酶，通過(guò)對(duì)酶催化機(jī)制的深入研究，揭示了鹵素基團(tuán)的引入所產(chǎn)生的位阻效應(yīng)是導(dǎo)致已有酶BCJ2315催化活力下降的關(guān)鍵因素，因此改造相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸以消除位阻成為該腈水解酶理性定制的重要線索，最終設(shè)計(jì)方案克服了位阻效應(yīng)，提高了腈水解酶BCJ2315對(duì)鄰-氯扁桃腈的催化活力及手性選擇性，催化活力提升為野生型的376%，值提高至98.7%，為光學(xué)純?chǔ)?羥基酸的生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐和理論支持，同時(shí)還將該腈水解酶的底物成功拓展到了氟、溴取代及不同位點(diǎn) (2、3、4位) 取代的芳香腈類的一系列重要化合物，其中有很多屬于重要藥物或前體[28]。另外，采用計(jì)算生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段揭示了腈水解酶具備腈水合酶活性的分子機(jī)制，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了腈水解酶到腈水合酶活力的理性切換[29]，為酰胺的生產(chǎn)提供了新的思路，為新酶挖掘提供了新的方法。作者解析了一種來(lái)自氧化葡萄糖酸桿菌的羰基還原酶GoCR的晶體結(jié)構(gòu)，采用計(jì)算生物學(xué)手段闡明了GoCR對(duì)不同底物立體偏好性與立體識(shí)別的分子機(jī)制，預(yù)測(cè)了結(jié)合口袋殘基對(duì)底物的定位、產(chǎn)物的選擇性所起到的關(guān)鍵作用。通過(guò)定點(diǎn)突變，構(gòu)建了單點(diǎn)突變株W193A，其不對(duì)稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE) 生成(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯 (R-HPBE)的值從野生型的43.2%提高到99%。此外，雙點(diǎn)突變株C93V/Y149A被證明能夠?qū)oCR立體選擇性逆轉(zhuǎn)，生成S-HPBE (=79.8%)，成功實(shí)現(xiàn)了氧化還原酶GoCR手性選擇性的雙向改造[30]。作者篩選了多個(gè)高性能氧化還原酶并解析了其結(jié)構(gòu)[31-32]，通過(guò)理性設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了氧化還原酶GOX2181輔酶特異性從NADH依賴型到NADH和NADPH兼容型，以及氧化還原酶GOX0502輔酶特異性從NADPH依賴型到NADH和NADPH兼容型的改造[31,33-34]。

2.2 多酶自組裝

多酶偶聯(lián)反應(yīng)體系可以改善底物在多個(gè)單一酶間的傳遞問(wèn)題，如縮短中間產(chǎn)物傳質(zhì)距離、提高反應(yīng)場(chǎng)所中間產(chǎn)物濃度等，從而可以提高多酶級(jí)聯(lián)整體催化效率，因而，人工構(gòu)建高效多酶偶聯(lián)反應(yīng)體系成為酶催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究之一。該技術(shù)的發(fā)展進(jìn)一步拓展了酶催化的應(yīng)用空間，其研究成果在醫(yī)藥、食品、環(huán)境保護(hù)、生物材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。完整高效的人工多酶反應(yīng)體系，不僅需要多種不同來(lái)源、不同功能的酶，還需從分子比例和空間結(jié)構(gòu)有序等方面考慮多酶的最優(yōu)化組裝，形成有機(jī)的多酶復(fù)合體。

近年來(lái)，研究者通過(guò)DNA支架、蛋白支架、病毒支架、RNA支架、共固定、層層包埋等，在胞外成功構(gòu)建了多個(gè)人工多酶反應(yīng)系統(tǒng)，Liu等[35]利用蛋白相互作用，成功構(gòu)建了三元蛋白支架，并將甲醛脫氫酶、醇脫氫酶、甲酸脫氫酶有序地固定在支架上，成功地將NADH的生成速率提高了5倍。胞內(nèi)無(wú)支架自組裝效率更高、操作更簡(jiǎn)便，可以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)蛋白聚集體的快速規(guī)模化制備，有利于構(gòu)建具有生物學(xué)功能的人工超分子器件，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。作者團(tuán)隊(duì)近年來(lái)在該方面開(kāi)展了一系列工作，利用甲酸脫氫酶(FDH) 自聚形成二聚體及亮氨酸脫氫酶(LDH) 自聚形成八聚體的特點(diǎn)結(jié)合SHM蛋白對(duì)的相互作用，實(shí)現(xiàn)了FDH和LDH在大腸桿菌胞內(nèi)無(wú)支架自組裝，形成了高度有序的多酶聚集體[36]，將輔酶NADH的循環(huán)效率提高了一倍多[37]。利用土曲霉來(lái)源的合成衣康酸的關(guān)鍵酶——烏頭酸脫羧酶和烏頭酸酶分別與PDZlig和PDZ進(jìn)行融合，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的共表達(dá)自組裝，成功將其靜息細(xì)胞催化檸檬酸合成衣康酸的產(chǎn)量提高了3倍[38]。通過(guò)SHM相互作用蛋白的介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了達(dá)瑪烯二醇合酶(PgDDS) 與角鯊烯環(huán)氧酶(ERG1) 在胞內(nèi)的共同定位，增強(qiáng)了PgDDS對(duì)2,3-氧化角鯊烯的競(jìng)爭(zhēng)性，減少了2,3-氧化角鯊烯的擴(kuò)散損失，產(chǎn)量提高了2倍[39]。以氧化葡萄糖酸桿菌為宿主細(xì)胞，通過(guò)多酶自組裝技術(shù)實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)參與赤蘚糖生物合成的級(jí)聯(lián)酶——異源核糖異構(gòu)酶(L-RI) 與該菌細(xì)胞膜上的山梨醇脫氫酶(SDH) 自組裝共定位，構(gòu)建了赤蘚糖一步發(fā)酵的重組菌，大幅提高了赤蘚糖在氧化葡萄糖酸桿菌中的產(chǎn)率和產(chǎn)量[40]。

2.3 細(xì)胞工廠

細(xì)胞工廠是生物制造的重要技術(shù)平臺(tái)，為生物質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用開(kāi)辟了新途徑，然而微生物代謝過(guò)程十分復(fù)雜，往往存在胞內(nèi)傳質(zhì)效率差、中間代謝物損耗大、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量低、結(jié)構(gòu)相似副產(chǎn)物多等問(wèn)題[41]，在積累了大量酶分子元件并對(duì)認(rèn)知其構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制或重構(gòu)高效的細(xì)胞工廠成為可能。作者團(tuán)隊(duì)針對(duì)甾體藥物及萜類化合物合成、多元醇定向轉(zhuǎn)化等方面開(kāi)展了研究。

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，其合成主要有兩種工藝路線：一種是從黃姜等薯蕷科植物中提取皂素進(jìn)行化學(xué)合成制取雙烯等甾體藥物核心原料，進(jìn)一步合成甾體藥物；另一種通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化制取雄烯二酮、9-羥基雄烯二酮、雄二烯二酮等甾體藥物核心原料，進(jìn)一步生產(chǎn)甾體藥物。以皂素為原料生產(chǎn)雙烯的工藝過(guò)程中存在嚴(yán)重的資源和環(huán)保問(wèn)題，微生物轉(zhuǎn)化工藝可解決或部分解決這些問(wèn)題，但微生物合成過(guò)程存在副產(chǎn)物多、結(jié)構(gòu)相似不易分離以及母核降解等共性難題，加之甾醇不溶于水，微生物對(duì)其轉(zhuǎn)化效率十分低下等，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了甾體制藥工業(yè)的整體發(fā)展。作者團(tuán)隊(duì)基于對(duì)甾醇微生物代謝的系統(tǒng)性分析、機(jī)制鑒定和代謝通路的調(diào)控，建立了針對(duì)甾醇代謝分枝桿菌的靶向性基因編輯平臺(tái)，可對(duì)目的基因進(jìn)行有效的敲除或敲入，創(chuàng)新發(fā)展了針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物高選擇性且低降解率的理性代謝工程菌種研發(fā)技術(shù)；在此基礎(chǔ)上，基于對(duì)分枝桿菌細(xì)胞被膜在甾醇攝取轉(zhuǎn)化過(guò)程中關(guān)鍵作用的認(rèn)知，發(fā)明了理性改造細(xì)胞被膜關(guān)鍵組分的關(guān)鍵技術(shù)，極大提高了微生物水相攝取并轉(zhuǎn)化甾醇的效率。從而成功創(chuàng)制了圍繞甾體藥物合成的細(xì)胞工廠，可以生產(chǎn)雄甾烯酮或C22羥基孕甾等系列甾體藥物中間體[42-44]。

萜類是重要的化學(xué)活性物質(zhì)，因其具有抗腫瘤、緩衰老、抗病毒等多種生理功能而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。目前萜類主要來(lái)源于植物提取和化學(xué)合成[45]，首先，原料來(lái)源限制了其廣泛應(yīng)用，其次，植物提取的產(chǎn)量和質(zhì)量易受地域、環(huán)境、季節(jié)、天氣的影響，加之化學(xué)合成過(guò)程中使用重金屬催化劑、副產(chǎn)物較多、環(huán)境影響較大等因素，使得另辟萜類生產(chǎn)途徑尤為迫切，利用微生物生產(chǎn)萜類化合物已成為引人矚目的發(fā)展方向。作者團(tuán)隊(duì)利用基因編輯技術(shù)，采取多個(gè)目標(biāo)酶于特定細(xì)胞器區(qū)室化表達(dá)的策略，在不同底盤細(xì)胞中，如鏈霉菌、釀酒酵母及大腸桿菌等，分別創(chuàng)建了萜類化合物高效合成平臺(tái)，目前已在單萜、倍半萜、二萜、三萜等化合物合成方面取得重要突破，如角鯊烯產(chǎn)量可達(dá)到10 g/L發(fā)酵液。

多元醇作為一種結(jié)構(gòu)多樣、應(yīng)用廣泛、生物利用度高的新一代平臺(tái)化合物而受到高度關(guān)注，然而因其富含活潑且化學(xué)性質(zhì)相似的多個(gè)羥基，“特定羥基的選擇性轉(zhuǎn)化”是極富挑戰(zhàn)性的技術(shù)難題。作者團(tuán)隊(duì)對(duì)生產(chǎn)維生素C的菌種之一——氧化葡萄糖酸桿菌開(kāi)展了長(zhǎng)達(dá)30多年的研究，通過(guò)對(duì)該菌代謝機(jī)制及醇脫氫酶功能的揭示，創(chuàng)造性地將該細(xì)胞構(gòu)建成為可選擇性氧化多元醇的細(xì)胞工廠，目前已可以催化合成近百種有價(jià)值的化合物[46]。

3 酶與生物催化技術(shù)應(yīng)用

酶催化劑在醫(yī)藥、食品、輕工、化工和環(huán)保等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4,47]，作者團(tuán)隊(duì)基于酶分子機(jī)器及細(xì)胞工廠的定制開(kāi)發(fā)了阿格列汀、西他列汀等手性胺類醫(yī)藥中間體[48]、伊魯替尼、克唑替尼、阿法替尼、他汀類等手性醇類醫(yī)藥中間體[49-50]、R-扁桃酸、R-鄰氯扁桃酸[28]等光學(xué)純?chǔ)?羥基酸、甾體、米格列醇、手性非天然氨基酸等綠色生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)了酶在醫(yī)藥、精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

3.1 手性非天然氨基酸

手性非天然氨基酸是合成手性藥物及其他手性精細(xì)化工品的重要原料。生物催化拆分制備手性非天然氨基酸已經(jīng)成為國(guó)際競(jìng)相追逐的產(chǎn)業(yè)方向之一。作者團(tuán)隊(duì)立足于國(guó)內(nèi)企業(yè)的生產(chǎn)現(xiàn)狀與國(guó)際市場(chǎng)的商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)及技術(shù)壁壘，將青霉素酰化酶用于催化拆分制備手性非天然氨基酸，解決了三大關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了眾多手性非天然氨基酸的高效生物催化制備[51-54]。提出了慢速利用碳源、前體成熟因子流加、C/N源平衡流加和比生長(zhǎng)速率調(diào)控等策略，使青霉素酰化酶發(fā)酵水平達(dá)到國(guó)際最高，創(chuàng)新集成了專用組成型表達(dá)技術(shù)與滲透提取技術(shù)，使青霉素?；柑峒兏?jiǎn)單，利用自主廉價(jià)固定化載體及固定化后修飾技術(shù)，使固定化青霉素?；富盍Ω?、穩(wěn)定性更好，使青霉素酰化酶適用于幾乎所有非天然手性氨基酸的制備，且立體選擇性高、得率高，在國(guó)內(nèi)多家企業(yè)實(shí)現(xiàn)了技術(shù)轉(zhuǎn)化。

3.2 甾體藥物中間體

針對(duì)如何推動(dòng)甾體制藥工業(yè)向綠色制造轉(zhuǎn)變這一行業(yè)重大需求，作者團(tuán)隊(duì)試圖利用生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)精減改革現(xiàn)有甾體藥物的合成路線，建立基于甾醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甾體藥物的基礎(chǔ)工業(yè)體系，從而創(chuàng)建了系列具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)能生物催化劑及集成化細(xì)胞工廠，形成了從基礎(chǔ)研究到技術(shù)發(fā)明、再到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用并產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益的完整產(chǎn)業(yè)鏈。作者團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建了系列高品質(zhì)甾醇轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞工廠和全新水相生產(chǎn)系統(tǒng)，已實(shí)現(xiàn)雄甾烯酮、C22羥基孕甾和A/B-環(huán)降解物等系列產(chǎn)品的生產(chǎn)，可用于雄性及蛋白同化激素、腎上腺皮質(zhì)激素、孕激素、雌激素等近300種甾體藥物合成[42-44]。鑒于這些產(chǎn)品可用于幾乎所有臨床用甾體藥物的合成，因此，本項(xiàng)目形成了可覆蓋幾乎所有甾體藥物合成所需前體的完整甾體制藥工業(yè)體系，對(duì)于我國(guó)甾體制藥工業(yè)企業(yè)的產(chǎn)業(yè)升級(jí)意義重大。通過(guò)與企業(yè)的產(chǎn)學(xué)研合作，相關(guān)技術(shù)已在多家知名甾體制藥企業(yè)得到了應(yīng)用推廣和產(chǎn)業(yè)化，已產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，有望打破甾體藥物國(guó)際大公司在高值藥品及其核心技術(shù)方面對(duì)中國(guó)的壟斷，從而破解我國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)高污染、低收益的甾體原料出口的困境。

3.3 多元醇及其平臺(tái)化合物

基于備受關(guān)注的新一代平臺(tái)化合物多元醇及其衍生物，作者團(tuán)隊(duì)利用自主創(chuàng)制的具備選擇性氧化多元醇的氧化葡萄糖酸桿菌[46]，實(shí)現(xiàn)了多元醇單一底物到單一產(chǎn)物的定向轉(zhuǎn)化，創(chuàng)建了以細(xì)胞催化劑為核心的酮糖、糖酸、羥基酸等多種產(chǎn)品的合成新途徑[55-56]。在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了菌體生長(zhǎng)和目的酶表達(dá)協(xié)同進(jìn)化及膜蛋白高效表達(dá)的氧化葡萄糖酸桿菌定向改造技術(shù)，提高細(xì)胞催化劑的催化效率，使細(xì)胞催化技術(shù)產(chǎn)業(yè)化成為可能[55,57-58]。同時(shí)提出了基于溶氧-C/N平衡培養(yǎng)策略，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞催化劑高密度、高活性、低成本生產(chǎn)[59]；建立了反應(yīng)-分離耦合消除酶抑制技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境下細(xì)胞催化劑的高效利用。以上研究形成了包括生物催化法生產(chǎn)米格列醇藥物、葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸、(S)-苯乙二醇、(R)--羥基異丁酸、二羥基丙酮等在內(nèi)的多項(xiàng)產(chǎn)業(yè)化成果。

4 結(jié)論與展望

生物技術(shù)被《“十三五”國(guó)家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》列為新一代產(chǎn)業(yè)新支柱和新增長(zhǎng)點(diǎn)[60]，并提出生物技術(shù)惠民工程，酶工程作為生物技術(shù)的核心模塊近年來(lái)得到快速發(fā)展。雖然酶分子定制、新酶挖掘工具的開(kāi)發(fā)、多酶組裝、細(xì)胞工廠定制等方面已經(jīng)獲得一定進(jìn)展，但依然存在較多問(wèn)題亟待解決，如更精準(zhǔn)的生物催化劑設(shè)計(jì)工具待開(kāi)發(fā)、細(xì)胞工廠代謝途徑與機(jī)制有待深入解析等。因而在今后的工作中需要不斷增強(qiáng)自主創(chuàng)新能力，特別是針對(duì)優(yōu)勢(shì)資源開(kāi)發(fā)自主的基因編輯技術(shù)、酶分子從頭設(shè)計(jì)、理性改造技術(shù)及細(xì)胞工廠元件裝配技術(shù)等。同時(shí)，加強(qiáng)產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，創(chuàng)新合作機(jī)制，充分融合市場(chǎng)敏銳度和科研創(chuàng)新能力，從而推動(dòng)綠色生物制造工業(yè)體系的快速發(fā)展。

[1] Sheldon RA, Pereira PC. Biocatalysis engineering: the big picture. Chem Soc Rev, 2017, 46(10): 2678–2691.

[2] Kataoka M, Miyakawa T, Shimizu S, et al. Enzymes useful for chiral compound synthesis: structural biology, directed evolution, and protein engineering for industrial use. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(13): 5747–5757.

[3] Bornscheuer UT, Huisman GW, Kazlauskas RJ, et al. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature, 2012, 485(7397): 185–194.

[4] Choi JM, Han SS, Kim HS. Industrial applications of enzyme biocatalysis: current status and future aspects. Biotechnol Adv, 2015, 33(7): 1443–1454.

[5] Gao B, Mao YZ, Zhang LJ, et al. A novel saccharifying α-amylase of Antarctic psychrotolerant fungi: gene cloning, functional expression, and characterization. Starch, 2016, 68(1/2): 20–28.

[6] Gao WY, Wu K, Chen LF, et al. A novel esterase from a marine mud metagenomic library for biocatalytic synthesis of short-chain flavor esters. Microb Cell Fact, 2016, 15: 41.

[7] Chen Y, Yi D, Jiang S, et al. Identification of novel thermostable taurine-pyruvate transaminase fromfor chiral amine synthesis. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(7): 3101–3111.

[8] Gao WY, Fan HY, Chen LF, et al. Efficient kinetic resolution of secondary alcohols using an organic solvent-tolerant esterase in non-aqueous medium. Biotechnol Lett, 2016, 38(7): 1165–1171.

[9] Liu N, Yang M, Mao XZ, et al. Molecular cloning and expression of a new α-neoagarobiose hydrolase from Agarivorans gilvus WH0801 and enzymatic production of 3,6-anhydro-L-galactose. Biotechnol Appl Biochem, 2016, 63(2): 230–237.

[10] Sun HH, Gao WY, Wang HL, et al. Expression, characterization of a novel nitrilase PpL19 fromwith-selectivity toward mandelonitrile present in active inclusion bodies. Biotechnol Lett, 2016, 38(3): 455–461.

[11] Yang Y, Sun JQ, Wu JJ, et al. Characterization of a novel α-L-Arabinofuranosidase from7 and rational design for its thermostability. J Agric Food Chem, 2016, 64(40): 7546–7554.

[12] Yang YY, Lin JP, Wei DZ. Heterologous overexpression and biochemical characterization of a nitroreductase from621H. Mol Biotechnol, 2016, 58(6): 428–440.

[13] Zhang BQ, Zheng LD, Lin JP, et al. Characterization of an ene-reductase fromfor asymmetric bioreduction of α, β-unsaturated compounds. Biotechnol Lett, 2016, 38(9): 1527–1534.

[14] Zhang GX, Liu P, Zhang L, et al. Bioprospecting metagenomics of a microbial community on cotton degradation: mining for new glycoside hydrolases. J Biotechnol, 2016, 234: 35–42.

[15] Zhao ZQ, Wang HL, Zhang YP, et al. Cloning and characterization of three ketoreductases from soil metagenome for preparing optically active alcohols. Biotechnol Lett, 2016, 38(10): 1799–1808.

[16] Chen SQ, Cai XH, Xie JL, et al. Structural and biochemical properties of a novel pullulanase ofDSM 3035. Starch, 2017, 69(1/2): 1500333.

[17] Cai XH, Chen SQ, Yang H, et al. Biodegradation of waste greases and biochemical properties of a novel lipase fromPS1. Canad J Microbiol, 2016, 62(7): 588–599.

[18] Truppo MD. Biocatalysis in the pharmaceutical industry: the need for speed. ACS Med Chem Lett, 2017, 8(5): 476–480.

[19] Yang HQ, Li JH, Shin HD, et al. Molecular engineering of industrial enzymes: recent advances and future prospects. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(1): 23–29.

[20] Goldsmith M, Tawfik DS. Enzyme engineering: reaching the maximal catalytic efficiency peak. Curr Opin Struct Biol, 2017, 47: 140–150.

[21] Yao ZQ, Zhang LJ, Gao B, et al. A semiautomated structure-based method to predict substrates of enzymes via molecular docking: a case study withlipase B. J Chem Inf Model, 2016, 56(10): 1979–1994.

[22] 酶底物虛擬篩選系統(tǒng)(CAESVSS). 國(guó)家軟件著作權(quán)登記號(hào)：2013SR108447.

[23] 蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定計(jì)算設(shè)計(jì)系統(tǒng)(ETSS). 國(guó)家軟件著作權(quán)登記號(hào)：2013SR108451.

[24] Jacques P, Béchet M, Bigan M, et al. High-throughput strategies for the discovery and engineering of enzymes for biocatalysis. Biopro Biosyst Eng, 2017, 40(2): 161–180.

[25] Romero-Rivera A, Garcia-Borràs M, Osuna S. Computational tools for the evaluation of laboratory-engineered biocatalysts. Chem Commun, 2016, 53(2): 284–297.

[26] Ebert MC, Pelletier JN. Computational tools for enzyme improvement: why everyone can-and should-use them. Curr Opin Chem Biol, 2017, 37: 89–96.

[27] Damborsky J, Brezovsky J. Computational tools for designing and engineering enzymes. Curr Opin Chem Biol, 2014, 19: 8–16.

[28] Wang HL, Gao WY, Sun HH, et al. Protein engineering of a nitrilase fromJ2315 for efficient and enantioselective production of ()-o-Chloromandelic acid. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(24): 8469–8477.

[29] Jiang SQ, Zhang LJ, Yao ZQ, et al. Switching a nitrilase fromsp. PCC6803 to a nitrile hydratase by rationally regulating reaction pathways. Catal Sci Technol, 2017, 7(5): 1122–1128.

[30] Deng J, Yao ZQ, Chen KJ, et al. Towards the computational design and engineering of enzyme enantioselectivity: a case study by a carbonyl reductase from. J Biotechnol, 2016, 217: 31–40.

[31] Yin B, Cui DB, Zhang LJ, et al. Structural insights into substrate and coenzyme preference by SDR family protein Gox2253 from. Prot: Struct Funct Bioinf, 2014, 82(11): 2925–2935.

[32] Liu X, Wang C, Zhang LJ, et al. Structural and mutational studies on an aldo-keto reductase AKR5C3 from. Prot Sci, 2014, 23(11): 1540–1549.

[33] Cui DB, Zhang LJ, Jiang SQ, et al. A computational strategy for altering an enzyme in its cofactor preference to NAD(H) and/or NADP(H). FEBS J, 2015, 282(12): 2339–2351.

[34] Cui DB, Zhang LJ, Yao ZQ, et al. Corrigendum to “Computational design of short-chain dehydrogenase Gox2181 for altered coenzyme specificity” J Biotechnol, 2016, 225: 67.

[35] Liu F, Banta S, Chen W. Functional assembly of a multi-enzyme methanol oxidation cascade on a surface-displayed trifunctional scaffold for enhanced NADH production. Chem Commun, 2013, 49(36): 3766–3768.

[36] Gao X, Zhao CC, Yu T, et al. Construction of a reusable multi-enzyme supramolecular device via disulfide bond locking. Chem Commun, 2015, 51(50): 10131–10133.

[37] Gao X, Yang S, Zhao CC, et al. Artificial multienzyme supramolecular device: highly ordered self-assembly of oligomeric enzymesand. Angew Chem, 2014, 53(51): 14027–14030.

[38] Yang ZW, Gao X, Xie H, et al. Enhanced itaconic acid production by self-assembly of two biosynthetic enzymes in. Biotechnol Bioeng, 2016, 114(2): 457–462.

[39] Zhao CC, Gao X, Liu XB, et al. Enhancing biosynthesis of a ginsenoside precursor by self-assembly of two key enzymes in. J Agric Food Chem, 2016, 64(17): 3380–3385.

[40] Zou XX, Lin JP, Mao XL, et al. Biosynthesis of L-erythrose by assembly of two key enzymes in. J Agric Food Chem, 2017, 65(35): 7721–7725.

[41] Wang Y, Li C. Metabolite transport and process enhancement in cell factories. Sci Sin, 2017, 47(5): 544–553.

[42] Xu LQ, Liu YJ, Yao K, et al. Unraveling and engineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism. Sci Rep, 2016, 6: 21928.

[43] Yao K, Xu LQ, Wang FQ, et al. Characterization and engineering of 3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase and 3-ketosteroid-9α-hydroxylase inATCC 25795 to produce 9α-hydroxy-4- androstene-3,17-dione through the catabolism of sterols. Metabo Eng, 2014, 24: 181–191.

[44] Yao K, Wang FQ, Zhang HC, et al. Identification and engineering of cholesterol oxidases involved in the initial step of sterols catabolism in. Metab Eng, 2013, 15: 75–87.

[45] Paramasivan K, Mutturi S. Progress in terpene synthesis strategies through engineering of. Crit Rev Biotechnol, 2017, 37(8): 974–989.

[46] Zhang H, Shi LL, Lin JP, et al. Effective improvement of the activity of membrane-bound alcohol dehydrogenase by overexpression ofin. Biotechnol Lett, 2016, 38(11): 1131–1138.

[47] Wang MX. Enantioselective biotransformations of nitriles in organic synthesis. Acc Chem Res, 2015, 48(3): 602–611.

[48] Zhu SJ, Ma XQ, Su EZ, et al. Efficient hydration of 2-amino-2,3-dimethylbutyronitrile to 2-amino-2,3-dimethylbutyramide in a biphasic system via an easily prepared whole-cell biocatalyst. Green Chem, 2015, 17(7): 3992–3999.

[49] Wu K, Chen LF, Fan HY, et al. Synthesis of enantiopure epoxide by ‘one pot’ chemoenzymatic approach using a highly enantioselective dehydrogenase. Tetrahedron Lett, 2016, 57(8): 899–904.

[50] Wu K, Wang HL, Chen LF, et al. Practical two-step synthesis of enantiopure styrene oxide through an optimized chemoenzymatic approach. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(20): 8757–8767.

[51] Deng SW, Ma XQ, Su EZ, et al. Efficient cascade synthesis of ampicillin from penicillin G potassium salt using wild and mutant penicillin G acylase from. J Biotechnol, 2016, 219: 142–148.

[52] Deng SW, Ma XQ, Sun M, et al. Efficient enzymatic synthesis of ampicillin using mutant Penicillin G acylase with bio-based solvent glycerol. Catal Commun, 2016, 79: 31–34.

[53] Deng SW, Su EZ, Ma XQ, et al. Efficient enzymatic synthesis of ampicillin by mutantpenicillin G acylase. J Biotechnol, 2015, 199: 62–68.

[54] Zhang YW, Wei DZ, Li DC, et al. Optimisation of enzymatic synthesis of cefaclor withproduct removal and continuous acyl donor feeding. Biocatal Biotransf, 2007, 25(1): 59–64.

[55] Zhang H, Shi LL, Mao XL, et al. Enhancement of cell growth and glycolic acid production by overexpression of membrane-bound alcohol dehydrogenase inDSM 2003. J Biotechnol, 2016, 237: 18–24.

[56] Wu J, Wang JL, Li MH, et al. Optimization of immobilization for selective oxidation of benzyl alcohol byusing response surface methodology. Bioresour Technol, 2010, 101(23): 8936–8941.

[57] Li DH, Lin JP, Wei DZ. Improvingperformance in theremoval of the inhibitor for asymmetric resolution of racemic 1-phenyl-1,2-ethanediol. Bioresour Technol, 2014, 159: 327–333.

[58] Shi YY, Li KF, Lin JP, et al. Engineered expression vectors significantly enhanced the production of 2-Keto-D-gluconic Acid by. J Agric Food Chem, 2015, 63(22): 5492–5498.

[59] Wei GD, Yang XP, Gan TL, et al. High cell density fermentation ofDSM 2003 for glycolic acid production. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36(8): 1029–1034.

[60] 國(guó)務(wù)院印發(fā)《“十三五”國(guó)家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》[EB/OL]. [2017-04-05]. http://news.bjx.com.cn/html/20161220/797888.shtml.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Customization of enzyme molecular machine and cell factory, leading the future of biomanufacturing industry

Shuiqin Jiang, and Dongzhi Wei

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Newworld Institute of Biotechnology, School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

The development and application of industrial enzymes have penetrated major industrial fields. China faces a major challenge as a large country in applying enzyme but a small one in producing enzyme. Biocatalysis has become an important technology and strategy of industrial development in the world since chemical catalysis encounters the crises from resource, energy and environment. The application of efficient and clean biocatalysis is one of the important ways to realize the sustainable development of chemical industry and to modernize the fermentation industry. From perspective of the industry-university-research cooperation, we reviewed the current status and the future development of enzyme engineering from the aspects of enzyme resources, customization of enzyme molecular machine and cell factory.

enzyme molecular machine, cell factory, biomanufacturing, industry development, catalysts customization

April 25, 2018;

June 5, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 21676090), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2017M621390), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 222201814037).

Dongzhi Wei. E-mail:dzhwei@ecust.edu.cn

10.13345/j.cjb.180161

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21676090)，中國(guó)博士后科學(xué)基金 (No. 2017M621390)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi) (No. 222201814037) 資助。