海灣扇貝精液超低溫冷凍保存技術(shù)的初步研究*

馬培振，張 哲，于瑞海，王昭萍**，李鵬飛

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.萊州市長(zhǎng)漁水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 261415)

海灣扇貝(Argopectenirradiansirradians)原產(chǎn)于北美洲大西洋西岸，于1980年代初被引入我國(guó)[1]，后發(fā)展成為主要扇貝養(yǎng)殖品種之一，引領(lǐng)第三次海水養(yǎng)殖浪潮[2]。受長(zhǎng)期近交影響，海灣扇貝體現(xiàn)出明顯的種質(zhì)退化、抗病能力減弱、規(guī)格減小等不足[3-4]，開展雜交育種、三倍體育種和種質(zhì)提純復(fù)壯[4-7]等遺傳改良工作成為大勢(shì)所趨。隨著種間及遠(yuǎn)緣雜交的進(jìn)行，如何保存海灣扇貝優(yōu)良種質(zhì)、避免種質(zhì)混亂以及可能引起的種質(zhì)衰退成為國(guó)內(nèi)水產(chǎn)界和科研界亟需解決的難題。

精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究自20世紀(jì)中葉開始以來，在陸地動(dòng)物、淡水及海水魚類、海洋貝類等方面均取得較大進(jìn)展[8-11]。主要冷凍流程包括精子獲取、稀釋液選取、抗凍保護(hù)劑選取、精液稀釋或濃縮、降溫、解凍、凍精質(zhì)量評(píng)估等，其中，研究多集中于稀釋液和抗凍保護(hù)劑的選擇、降溫和解凍方式，以及精子質(zhì)量評(píng)估等[11,15,20]。在海洋貝類中，又以牡蠣的精子冷凍保存研究為多[9，12-14]，扇貝相對(duì)較少，僅見于蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[15-16]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[15,17]、紫扇貝(A.purpuratus)[18]等經(jīng)濟(jì)品種，而未有海灣扇貝精子超低溫冷凍保存及應(yīng)用相關(guān)報(bào)導(dǎo)。精子超低溫冷凍技術(shù)可以使不同自然繁殖時(shí)期和地域的生物，利用凍精的保存或運(yùn)輸進(jìn)行近緣或遠(yuǎn)緣雜交，突破季節(jié)限制，避免親本運(yùn)輸，同時(shí)避免引種過程中可能帶入的其他微生物，可推動(dòng)貝類的種質(zhì)和遺傳多樣性保護(hù)，在遺傳性狀改良等方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值。本研究采用傳統(tǒng)分步降溫法，對(duì)海灣扇貝精子超低溫冷凍保存技術(shù)進(jìn)行探討，以期掌握海灣扇貝精子超低溫冷凍技術(shù)流程與要點(diǎn)，對(duì)于海灣扇貝種質(zhì)資源保存、跨季跨域雜交等研究有指導(dǎo)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

海灣扇貝為萊州市長(zhǎng)漁水產(chǎn)有限公司蓄養(yǎng)至性腺成熟的一齡親貝，分別采用自然排放法與人工解剖取精法獲取精液。自然排放在盛有潔凈升溫(23℃)海水的1L燒杯中進(jìn)行；解剖取精時(shí)，首先將扇貝兩殼打開，將精巢外表擦拭干凈，然后用消毒后的解剖剪剖開精巢表皮，剪取潔凈的精塊置于少量海水中，攪拌使精子活化并散開。

超低溫冷凍保存裝置選用YDS-30-125型液氮罐。

1.2 抗凍保護(hù)液配制

分別使用二甲基亞砜(DMSO)和甘油(GLY)作為抗凍保護(hù)劑。以過濾后升溫(23℃)海水為基礎(chǔ)稀釋液，分別配制濃度為5%、10%、15%、20%和25%的DMSO和2%、4%、6%、8%、10%的GLY，以及5% DMSO和5% GLY的混合溶液作為抗凍保護(hù)液。

1.3 精液稀釋與分裝

分別以抗凍液與精液體積比為1∶1、2∶1、3∶1對(duì)精液進(jìn)行稀釋，總體積控制在0.5～1 mL，保存于1.8 mL凍存管中，混勻后，固定墜子，置于4℃平衡5 min。

1.4 降溫及投氮保存

測(cè)定液氮面深度。體系經(jīng)平衡后，分別按以下程序進(jìn)行降溫后，投入液氮保存。Ⅰ組：液氮罐罐口處和液氮面上方10 cm處分別停留10 min；Ⅱ組：液氮面上方10 cm處停留5 min；Ⅲ組：液氮面上方20 cm、3 cm處分別停留5 min。

1.5 凍精解凍及質(zhì)量檢測(cè)

精液凍存后，分別于20、25、30和35℃的水浴環(huán)境中解凍。解凍后，顯微鏡下采用區(qū)域觀察法統(tǒng)計(jì)精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，以活化(晃動(dòng)和游動(dòng))精子的百分比評(píng)價(jià)凍精質(zhì)量和冷凍效果。分別冷凍1、15和30 d后，取最佳冷凍效果下的解凍精子與蝦夷扇貝自然產(chǎn)卵子人工授精，觀察胚胎發(fā)育狀況，統(tǒng)計(jì)受精率、卵裂率和孵化率。

2 結(jié)果

2.1 精子收集方式對(duì)冷凍效果的影響

分別采用自然排精和解剖取精的方法收集精液，與20%DMSO以體積比1∶2混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1d并30℃水浴解凍后，所得精液活力及冷凍后效果見圖1。結(jié)果顯示，2種方式獲得的精子，在冷凍前活力均較高，差異不顯著(P>0.05)；解凍后，自然排放組精子活力為9.0%±3.6%，明顯低于解剖取精組(49.3%±7.4%)(P<0.05)。

2.2 抗凍液

解剖取精，與不同的抗凍保護(hù)劑以體積比1∶2混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1 d并30℃水浴解凍后，冷凍結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，不同的抗凍保護(hù)劑對(duì)精子冷凍效果的影響有差異。使用DMSO作為抗凍劑，對(duì)精子冷凍的保護(hù)效果最好，當(dāng)DMSO濃度為20%時(shí)，精子活力最高，達(dá)到79.0%；使用GLY作為抗凍劑，精子冷凍效果較差，精子活力最高僅為29.3%，與DMSO的最佳保護(hù)效果差異顯著(P<0.05)。當(dāng)DMSO和GLY各5%混合使用作為抗凍保護(hù)液時(shí)，精子活力達(dá)到32.3%，顯著優(yōu)于僅使用GLY作為抗凍保護(hù)劑的冷凍效果(P<0.05)。

圖1 收集方式對(duì)精子冷凍效果的影響Fig.1 Effect of collecting methods on sperm cryopreservation

圖2 抗凍保護(hù)劑對(duì)精子冷凍效果的影響Fig.2 Effect of cryoprotectant agent(CPA) on sperm cryopreservation

2.3 精液稀釋

解剖取精，與20%DMSO以不同體積比稀釋混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1 d并30℃水浴解凍，精子冷凍效果見圖3。當(dāng)體積比為2∶1和3∶1時(shí)，冷凍效果均好，精子活力分別達(dá)到75.7%±6.0%和71.7%±7.6%，差異不顯著(P>0.05)；1∶1時(shí)，冷凍效果最差，為50.7%。

2.4 降溫程序

解剖取精，與20%DMSO以體積比1∶2混合，使用3個(gè)不同降溫程序，冷凍1d并30℃水浴解凍后，精子冷凍效果見表1，3組差異顯著(P<0.05)。當(dāng)精液在液氮面上10 cm處停留5 min后投入液氮，精子活力最高，達(dá)到69.4%±5.3%；精子在液氮罐罐口處(液氮面距罐口25 cm)和液氮面上方10 cm處分別停留10 min，再投入液氮，凍精活力最差，且標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，結(jié)果不穩(wěn)定，平均為31.5%；精子在液氮面20和3 cm處分別停留5 min后投入液氮，精子活力能夠達(dá)到55.0%±6.6%。

圖3 精液稀釋比例對(duì)精子冷凍效果的影響Fig.3 Effect of dilution ratio of sperm on cryopreservation

表1 降溫程序?qū)永鋬鲂Ч挠绊慣able 1 Effect of freezing steps on sperm cryopreservation

2.5 解凍水浴溫度

解剖取精，與20%DMSO以體積比1∶2混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1 d后，凍精在4種水浴溫度下解凍，所得精子活力情況見圖4。當(dāng)水浴溫度為30℃時(shí)，所得精子活力最高，達(dá)到80.7%±7.6%；水浴溫度為25℃時(shí)，精子活力也較高，為77.0%±7.5%，與水浴溫度為30℃時(shí)差別不顯著(P>0.05)；水浴溫度為20℃時(shí)，精子活力最低，僅為30.3%±5.0%。

2.6 活力檢測(cè)

以解剖的方式獲取海灣扇貝精子，用濃度20%的DMSO作為抗凍保護(hù)劑，與精液以2∶1均勻混合，總體積不超過1 mL。4℃平衡5 min后，于液氮面以上10 cm穩(wěn)定5 min，投入液氮冷凍保存。解凍時(shí)，于30℃水浴中搖動(dòng)融化。此方案得到的冷凍后海灣扇貝精子活力最高，晃動(dòng)和游動(dòng)精子比例達(dá)到86.0%。將海灣扇貝精子與蝦夷扇貝卵子進(jìn)行人工授精，受精和孵化情況見表2。

圖4 水浴溫度對(duì)凍精解凍效果的影響Fig.4 Effect of thawing temperature on sperm cryopreservation

表2 海灣扇貝凍精對(duì)蝦夷扇貝卵子受精孵化的影響Table 2 Results of crossing fertilization by cryopreserved sperm of A.i.irradians

結(jié)果顯示，無論是解剖精子還是解凍精子均可以使蝦夷扇貝卵子受精并孵化。海灣扇貝凍精進(jìn)行雜交的受精率、卵裂率、孵化率均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；冷凍保存1、15和30 d后的精子在活力、受精率、卵裂率和孵化率方面均差異顯著(P<0.05)，未呈現(xiàn)規(guī)律性。

3 討論

海洋貝類精子超低溫冷凍一般使用分步降溫法或程序降溫法進(jìn)行，其中程序降溫法借助于程序降溫儀，基于電腦程序，按照預(yù)設(shè)的程序進(jìn)行降溫，對(duì)于降溫操控較為精確；而分步降溫法則具有操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低[19]等優(yōu)點(diǎn)，保存效果良好[9]，因此應(yīng)用更為廣泛。本研究使用分步降溫法，對(duì)海灣扇貝精子冷凍技術(shù)流程進(jìn)行探究，完善扇貝精子超低溫冷凍保存技術(shù)。

貝類精子質(zhì)量取決于親貝種質(zhì)和性腺發(fā)育程度，同時(shí)受外界環(huán)境等因素的影響。獲取高質(zhì)量、高數(shù)量的精子是冷凍操作成功的前提。常規(guī)精子冷凍方案不適用于稀少精子冷凍[27]，而質(zhì)量較差、活力弱的精子在冷凍和復(fù)蘇過程中更易導(dǎo)致精子核DNA損傷，影響凍存后生理功能[28]。解剖取精方式在牡蠣[12-14,20-21]、珍珠貝[22-23]等貝類的精子超低溫冷凍中應(yīng)用廣泛，而扇貝中主要以自然排放的方式獲取精液[15-17]。然而，自然排放的精液易受排泄物、組織粘液等污染，同時(shí)精子濃度較小、濃縮困難[24]，對(duì)精子冷凍保存效果造成影響。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)海灣扇貝性腺成熟個(gè)體解剖取精，精子濃度高、活力良好，且解凍后精子活力優(yōu)于自然排放后的凍存精子，這可能是由于研究中自然排放的精子濃度較低、精子長(zhǎng)時(shí)間激活而能量損耗嚴(yán)重等原因?qū)е碌腫14,16,27]。

精子在超低溫冷凍過程中，胞內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧和大冰晶易對(duì)精子核DNA、膜結(jié)構(gòu)以及頂體酶活性造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷[28-29]?？箖霰Ｗo(hù)劑能夠控制水分滲透速度從而穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[30]，并且能夠保護(hù)精子DNA免受損傷[28]。因此，選擇合適的抗凍保護(hù)劑和稀釋液是精子冷凍保存成敗的關(guān)鍵[29]。DMSO作為最常用的滲透性抗凍保護(hù)劑，在很多物種的精子冷凍操作中最適濃度相差不大[9,31]。研究發(fā)現(xiàn)，在以分步降溫法進(jìn)行扇貝精子超低溫冷凍的實(shí)驗(yàn)中(見表3)[15-16]，DMSO均為最佳的抗凍保護(hù)劑，終濃度范圍均為10%～20%，體現(xiàn)出DMSO在不同扇貝中適用的普遍性。GLY對(duì)精子凍存有一定保護(hù)作用，且作用濃度較低，但單一使用時(shí)效果不佳，可用作抗凍添加劑，與DMSO共同使用以增強(qiáng)保護(hù)效果，這與丁兆坤[31]的結(jié)果一致。

表3 不同扇貝分步降溫法精子超低溫冷凍的比較Table 3 Comparison of sperm cryopreservation by freezing by steps among different scallops

注:降溫程序*: 為于液氮面上方一定距離停留的時(shí)間。
Note: Distance above liquid nitrogen surface are shown here with time marked in brackets.

降溫速度影響精子細(xì)胞內(nèi)水分的滲出速率，選擇合理的降溫程序，可以控制胞內(nèi)冰晶形成與滲透壓升高的平衡，將精子的損傷降至最低水平[9,17]。分步降溫法即通過控制樣品在液氮面上方的高度和時(shí)間，從而控制降溫速度，并最終轉(zhuǎn)入液氮保存。該法雖不能獲取確切的降溫參數(shù)，但可大批量?jī)龃婢?，冷凍效果較好。本研究中，當(dāng)海灣扇貝精液在液氮面上10 cm處停留5 min后投入液氮，精子活力最高。研究發(fā)現(xiàn)，凍存體系的解凍速率也會(huì)影響精子活力。不同扇貝精子解凍的最適水浴溫度有差異(見表3)，但尚未有解凍水浴溫度與物種生物學(xué)相關(guān)性的研究[9]。

凍精質(zhì)量檢測(cè)的常用方法有活動(dòng)精子比率、受精率、精子結(jié)構(gòu)檢測(cè)等[9]，本研究中綜合活動(dòng)精子比率和受精率來判定凍精質(zhì)量。海灣扇貝為雌雄同體，采用過濾或淡水消毒法等難以收集到未受精的純凈卵子，而解剖獲得的卵子在生理上不成熟，不能直接受精或者受精率極低[26]，因此本研究選擇工廠化育苗過程中與海灣扇貝苗種生產(chǎn)季節(jié)有一定時(shí)間重合的蝦夷扇貝自然排放的卵子與海灣扇貝凍精進(jìn)行授精以評(píng)估凍精質(zhì)量，該方法簡(jiǎn)單、可行，效果良好。然而，由于兩者配子兼容性有限，蝦夷扇貝卵子與海灣扇貝正常精子雜交的受精率、卵裂率、孵化率均較低[32]，而使用海灣扇貝凍精時(shí)受精率、卵裂率、孵化率更低，體現(xiàn)出冷凍操作對(duì)精子結(jié)構(gòu)或能量的損傷作用。

精子冷凍保存作為種質(zhì)資源保護(hù)的重要手段，在陸生動(dòng)物和海洋動(dòng)物中均有十分重要的科研和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[9, 12]。本研究發(fā)現(xiàn)，海灣扇貝凍精復(fù)蘇后的生理功能和活力與保存時(shí)間沒有顯著關(guān)聯(lián)，證實(shí)了液氮超低溫保存的穩(wěn)定性以及分步降溫法進(jìn)行精子冷凍以長(zhǎng)期保存的可行性，對(duì)于生物精子庫(kù)的建立和完善具有較大的推動(dòng)作用。

4 結(jié)語(yǔ)

本文采用分步降溫法對(duì)海灣扇貝解剖精子進(jìn)行超低溫冷凍保存，開發(fā)冷凍方法和流程。以升溫的自然海水(23 ℃)為基礎(chǔ)稀釋液，以終濃度13.3%的二甲基亞砜為抗凍保護(hù)劑，體系經(jīng)4℃平衡和液氮面以上10 cm穩(wěn)定5 min后，投入液氮冷凍，可長(zhǎng)期保存。解凍時(shí)，于30 ℃水浴中搖動(dòng)融化。此方案對(duì)海灣扇貝精子超低溫冷凍保存效果最好，可得到具有良好活力和生理功能的精子。使用蝦夷扇貝卵子檢驗(yàn)海灣扇貝精子超低溫冷凍保存效果，方法簡(jiǎn)單、可行。本研究為海灣扇貝種質(zhì)資源保存、跨季雜交育種等實(shí)踐活動(dòng)提供了參考。但是，扇貝精子超低溫冷凍領(lǐng)域研究較少，品種偏少、技術(shù)流程尚不完善，如何優(yōu)化冷凍流程以獲得更高活力和生理功能的凍精，從而發(fā)揮海洋貝類精子庫(kù)的作用、解決實(shí)踐應(yīng)用等問題仍是當(dāng)前種質(zhì)資源保護(hù)的主要難題。