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    龍須菜hsp和gln基因克隆及其在不同品系發(fā)育過程中表達(dá)分析*

    2018-07-30 03:28:44李曉東隋正紅商二磊劉昊昕
    關(guān)鍵詞:紅藻龍須菜谷氨酰胺

    彭 沖,李曉東,隋正紅,商二磊,劉昊昕

    (中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

    龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)隸屬于江蘺科(Gracilariaceae)[1-3],是中國的一種重要的經(jīng)濟(jì)海藻,生產(chǎn)瓊膠的重要原料[4]。龍須菜具有紅藻門中典型的三世代型生活史,由四分孢子體世代、果孢子體世代和配子體世代組成[5]。龍須菜的生活史可以在實(shí)驗(yàn)室條件下完成,可以作為一種理想的遺傳學(xué)研究材料[6]。王津果等將龍須菜的發(fā)育過程分成了4個(gè)階段[7],龍須菜具體發(fā)育階段的確認(rèn)與劃分,為其育性表現(xiàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。

    熱激蛋白(hot shock protein,hsp)是一類廣泛分布于各類生物細(xì)胞內(nèi)且高度保守的蛋白分子,在高溫、干旱、過氧化、重金屬等逆境下均能大量表達(dá)[8],主要通過參與蛋白合成、折疊、細(xì)胞定位及蛋白降解等多種生物功能來維持植物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9],在植物抵御逆境及適應(yīng)環(huán)境過程發(fā)揮重要作用[10],行使分子伴侶、應(yīng)激防御和穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)等功能,不僅受環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)也參與細(xì)胞各項(xiàng)正常生理活動(dòng)[11]。

    在高等植物中,谷氨酰胺(glutamine,gln)合成酶是氮素代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一,它可以聯(lián)合谷氨酸合成酶催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[12]。有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶與生物育性相關(guān)。谷氨酰胺合成酶在盤基網(wǎng)柄菌孢子母細(xì)胞中的活性比在柄細(xì)胞中的活性高約4倍,為谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育提供了證據(jù)[13]。谷氨酰胺合成酶在水稻花粉成熟過程中起到重要作用,抑制谷氨酰胺合成酶活性,會(huì)使水稻圓錐花序中的氨積累,而導(dǎo)致水稻不育[13]。

    研究發(fā)現(xiàn),魯龍1號(hào)與龍須菜野生型之間的孢子放散數(shù)量并未出現(xiàn)顯著差異,而981釋放的孢子數(shù)量卻是最少,比野生型孢子放散量少一到2個(gè)數(shù)量級(jí),呈現(xiàn)顯著差異[7]。本研究針對(duì)龍須菜981品系與魯龍1號(hào)表現(xiàn)出不同的育性性狀的這一現(xiàn)象,結(jié)合已完成981品系和魯龍1號(hào)品系的不同發(fā)育階段龍須菜的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作,挑選出在不同發(fā)育階段差異表達(dá)顯著的2個(gè)基因(hsp和gln),通過測(cè)序分析和熒光定量PCR技術(shù),從單個(gè)基因水平,對(duì)龍須菜981低育原因進(jìn)行探究,為研究紅藻發(fā)育調(diào)控提供了新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    龍須菜981品系和魯龍1號(hào)品系的四分孢子體樣品采集于青島膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)(36°08′N, 120°17′E)。將表面的附生生物、泥沙等肉眼可見的污染物沖洗干凈后,挑選生長狀態(tài)良好的藻株置于潔凈滅菌的廣口錐形瓶中,加入含有Pro培養(yǎng)基[14]的滅菌海水,置于22 ℃、鹽度30、光照50 μmol·m-2·s-1、光暗周期12/12h L/D的條件下馴養(yǎng)1周,中間更換1次海水加入新的培養(yǎng)基。

    實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)1周后,將981和魯龍1號(hào)樣品置于最佳孢子放散條件下培養(yǎng),即25 ℃、15 μmol·m-2·s-1、鹽度35、光暗周期8/16~14/10 h L/D[15],培養(yǎng)過程中利用光學(xué)顯微鏡觀察藻體表面,根據(jù)王津果等[7]劃分的龍須菜不同發(fā)育階段的特征判斷樣品藻體的發(fā)育階段,用消毒的刀片分別對(duì)處于各發(fā)育階段的龍須菜樣品進(jìn)行取樣,每份樣品約0.2 g,液氮中速凍后置于-80 ℃保存。

    1.2 基因組DNA的提取及cDNA的制備

    利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根)對(duì)龍須菜樣品基因組DNA進(jìn)行提取。利用植物RNA提取試劑盒(OMEGA)對(duì)龍須菜樣品進(jìn)行總RNA的提取,利用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀測(cè)定提取RNA的濃度以及OD260/OD280,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara),參照說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,置于-20 ℃條件下保存。

    1.3 hsp和gln全基因序列與上游序列的獲得及基因片段克隆

    根據(jù)龍須菜全基因組Survey數(shù)據(jù)[16]和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中hsp和gln基因序列[17],使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2基因的全長擴(kuò)增引物(-all)、上游序列擴(kuò)增引物(-up)和熒光定量引物(-q),選擇gapdh基因[18]和18s基因[19]作為熒光定量PCR的雙內(nèi)參基因(見表1)。

    表1 本研究所用引物序列Table 1 The sequence of primers used in this study

    PCR反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 2 μL,25 mmol/L的MgCl21.2 μL,2.5 mmol/L的dNTP 1.5 μL,10 μmol/L的正反向引物各1 μL,1 U的TaqDNA聚合酶和20 ng全基因組DNA模板。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,1個(gè)循環(huán);94 ℃變性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s(在基因片段克隆的擴(kuò)增反應(yīng)中設(shè)為45 s),30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?;蛉L序列與上游序列的PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司,用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

    已發(fā)現(xiàn)在龍須菜中18s和gapdh這2個(gè)基因表達(dá)恒定,因此在本研究用作參照基因,雙參照基因相比單內(nèi)參能夠減小內(nèi)參基因方面引起的誤差,使結(jié)果更加準(zhǔn)確。以雙內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)龍須菜2個(gè)品系不同階段的樣品進(jìn)行歸一化處理,就可以在不同的樣品間對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行比較分析。hsp、gln、18s、gapdh熒光定量引物擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)進(jìn)行目的條帶回收。參照PMD18-T說明書,將回收的目的條帶與PMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株中,PCR檢測(cè)顯示陽性克隆的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h,然后利用質(zhì)粒提取試劑盒(天根)提取菌液質(zhì)粒,提取的質(zhì)粒于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 序列的生物信息學(xué)分析

    用BioEdit v7.0軟件[20]檢查雙向測(cè)序的結(jié)果,刪除序列兩端背景雜亂堿基,并利用MEGA6.0軟件拼接得到基因全長序列和上游序列,然后分別與龍須菜轉(zhuǎn)錄組和全基因組Survey數(shù)據(jù)中基因所在的Scaffold片段進(jìn)行比對(duì),確定目的基因的存在及其序列信息。利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推測(cè)開放閱讀框,結(jié)合MEGA6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列翻譯。蛋白質(zhì)的分子量與等電點(diǎn)使用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行預(yù)測(cè);利用SignalP2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)分析蛋白信號(hào)肽;跨膜區(qū)通過TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行分析;利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析;將獲得的hsp和gln氨基酸序列在NCBI上通過BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab)進(jìn)行同源性比對(duì)分析,下載其他物種的hsp和gln氨基酸序列分別與獲得的氨基酸序列一起使用Clustal X軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析,通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹,用Bootstrap法對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行評(píng)估,Bootstrap設(shè)置為1 000次重復(fù)。利用PantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)獲得的hsp和gln基因的上游序列的啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析。

    1.5 hsp和gln基因的表達(dá)分析

    以1.3中提取的質(zhì)粒為模板,按1∶10梯度用滅菌雙蒸水進(jìn)行稀釋,共設(shè)8個(gè)梯度,每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù),分別以hsp-q、gln-q、18s-q、gapdh-q(見表1)為引物,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),PCR體系中包含有10 μL的LightCycler 480 SYBR Green I Master,10 μmol/L的正反向引物各1 μL,1 μL模板,其余的用滅菌的ddH2O補(bǔ)足20 μL體系。在Roche LightCycler480實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃10 s,45個(gè)循環(huán);95 ℃5 s,65 ℃1 min,1個(gè)循環(huán);40 ℃ 10 s,1個(gè)循環(huán)。根據(jù)得到的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)引物是否符合熒光定量PCR要求(擴(kuò)增效率在95%~105%)。

    以1.2中來自龍須菜981品系和魯龍1號(hào)品系不同發(fā)育階段的cDNA為模板,每份樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù),依照上述步驟分別進(jìn)行hsp、gln、18s、gapdh的熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算[21],并利用SPSS軟件采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性系統(tǒng)學(xué)分析(P),并利用Origin6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

    2 結(jié)果

    2.1 hsp、gln基因的獲得及氨基酸序列分析

    hsp基因序列全長501 bp,編碼166個(gè)氨基酸,分子量為19.05 kD,理論等電點(diǎn)為6.38。帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp + Glu)為23個(gè),帶正電的氨基酸殘基(Arg + Lys)為21個(gè),不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在49~164 aa處為HSP20結(jié)構(gòu)域(見圖1)。龍須菜Hsp的氨基酸序列與其它物種序列的比對(duì)如圖1所示,龍須菜的Hsp序列與其它物種存在較大差異,與星球蟲科Tetrasphaeraaustraliensis相似性為35%,與其他物種,如杉藻科的角叉菜(Chondruscrispus),酵母科的Schizosaccharomycesoctosporus、綠菌門的Chlorobibacterium、放線菌目的Phycicoccussp.、Friedmanniellaflava、Rhodococcussp.與Knoelliaaerolata,相似性范圍為28%~34%。Hsp序列中共有8個(gè)保守位點(diǎn),均處于HSP20結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

    (實(shí)線表示蛋白功能預(yù)測(cè)HSP20區(qū);陰影部分為保守區(qū)域;相同氨基酸用“*”表示,相似氨基酸用“.”與“:”表示。Solid line indicated predicted protein function region of HSP 20;shade part was conserved region;identical amino acids indicated by “*”,and similar ones by “·” and “:”.Phycicoccussp.(WP_056923286.1);紅球菌Rhodococcussp(WP_032374627.1);Tetrasphaeraaustraliensis(CCH71736.1);紅球菌Rhodococcussp.(WP_057473142.1);Friedmanniellaflava(SEQ28565.1);紅球菌Rhodococcussp.(WP_027494920.1);角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005713022.1);Phycicoccussp.(WP_057378702.1);Tetrasphaeraaustraliensis(WP_048701086.1);角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005710585.1);Gracialriopsislemaneiformis(本研究);紅球菌Rhodococcussp.(WP_008711816.1);Knoelliaaerolata(WP_035937060.1);角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005710590.1);八孢裂殖酵母Schizosaccharomycesoctosporus(XP_013018981.1);Chlorobibacterium(KXB97182.1))
    圖1 Hsp序列比對(duì)結(jié)果
    Fig.1 The amino acid sequences alignment ofhspgene

    gln基因序列全長1 209 bp,編碼402個(gè)氨基酸,分子量為43.91 kD,理論等電點(diǎn)為5.57。帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp + Glu)為49個(gè),帶正電的氨基酸殘基(Arg + Lys)為43個(gè),不存在信號(hào)肽,存在2個(gè)跨膜區(qū),分別為TMⅠ(位置1~18 aa,長度18 aa,方向?yàn)槟ね庀蚰?nèi))和TMⅡ(位置47~69 aa,長度23,方向?yàn)槟ね庀蚰?nèi))(見圖2)。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在29~41 aa的位置,存在一段長13 aa的低復(fù)雜性區(qū)域(Low complexity region,LCR)(見圖2)。在65~144 aa位置為谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域(見圖2)。龍須菜與角叉菜(Chondruscrispus)的Gln序列相似性最高,為73%,與其他物種如紅藻綱的Dixoniellagrisea、真紅藻綱的細(xì)毛石花菜(Gelidiumcrinale)、溫泉紅藻綱的Galdieriasulphuraria、雙子葉植物綱的胡蘿卜(Daucuscarotasubsp.sativus)、酸棗(Ziziphusjujube)、可可(Theobromacacao)、芝麻(Sesamumindicum)、苧麻(Boehmerianivea)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)、楊樹(Populustrichocarpa)和PopulussimoniixPopulusnigra,相似性范圍為56%~69%。將龍須菜的Gln序列與其它物種的序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)共有124個(gè)保守位點(diǎn),有30個(gè)保守位點(diǎn)在谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域中。龍須菜Gln的谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域與紅藻門的Dixoniellagrisea、Galdieriasulphuraria、細(xì)毛石花菜(Gelidiumcrinale)序列結(jié)構(gòu)相近。龍須菜Gln中的TMⅠ、TMⅡ跨膜區(qū)、LCR為龍須菜中特有的序列區(qū)域。

    (實(shí)線框表示預(yù)測(cè)跨膜區(qū),雙箭頭實(shí)線表示預(yù)測(cè)LCR區(qū),實(shí)線表示預(yù)測(cè)的谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域;陰影部分為保守區(qū)域;相同氨基酸用“*”表示,相似氨基酸用“.”與“:”表示。Solid frame indicated predicted trans-membrane region;solid double arrow indicated LCR region;solid line indicated predic ted N-terminal domain of glutamine synthase;shade part was conserved region;indentical amino acids indicated by “*”,and similar ones by “·” and “:”.楊樹Populustrichocarpa(XP_002312733.1)、PopulussimoniixPopulusnigra(ALJ94030.1)、酸棗Ziziphusjujube(XP_015888259.1)、麻瘋樹Jatrophacurcas(XP_012069490.1)、苧麻Boehmerianivea_1(AJI44225.1)、苧麻Boehmerianivea_2(AJD14836.1)、芝麻Sesamumindicum(XP_011090823.1)、胡蘿卜Daucuscarotasubsp.sativus(XP_017223067.1)、角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005712206.1)、Galdieriasulphuraria(XP_005705248.1)、Dixoniellagrisea_1(ADX97446.1)、Dixoniellagrisea_2(ADX97445.1)、細(xì)毛石花菜Gelidiumcrinale(AAK60408.1)、角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005717136.1)、角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005717133.1))
    圖2 Gln序列比對(duì)結(jié)果
    Fig.2 The amino acid sequences alignment ofglngene

    2.2 氨基酸序列進(jìn)化分析

    Hsp序列系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3,整個(gè)NJ樹的樹形分為1個(gè)較大的類群和1個(gè)較小的類群,較小類群由角叉菜組成,龍須菜與紅球菌、八孢裂殖酵母和其他細(xì)菌序列聚合成一支較大的類群。

    Gln序列系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4,進(jìn)化樹分為2個(gè)大類群,一大類群由雙子葉植物綱的植物組成,一大類群由紅藻門海藻組成,這與氨基酸序列對(duì)比的結(jié)果一致。龍須菜處于紅藻門海藻的類群中,先與角叉菜聚為一支,然后與Galdieriasulphuraria聚為一支,最后與Dixoniellagrisea和角叉菜所在的分支聚為大枝。

    (Phycicoccussp.1(WP_056923286.1)、Phycicoccussp.2(WP_057378702.1)、Knoelliaaerolata(WP_035937060.1)、Tetrasphaeraaustraliensis_1(CCH71736.1)、Tetrasphaeraaustraliensis_2(WP_048701086.1)、Friedmanniellaflava(SEQ28565.1)、紅球菌Rhodococcussp.1(WP_008711816.1)、紅球菌Rhodococcussp.2(WP_032374627.1)、紅球菌Rhodococcussp.3(WP_057473142.1)、紅球菌Rhodococcussp.4(WP_027494920.1)、八孢裂殖酵母Schizosaccharomycesoctosporus(XP_013018981.1)、Chlorobibacterium(KXB97182.1)、龍須菜Gracilariopsislemaneiformis(KY971285)(本實(shí)驗(yàn))、角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005710585.1)、角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005713022.1)、角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005710590.1))
    圖3 基于hsp氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹
    Fig.3 NJ tree based onhspamino acids

    2.3 hsp、gln基因上游序列的啟動(dòng)子元件分析

    測(cè)序獲得hsp基因上游序列807 bp和gln基因上游序列951 bp分別進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析,hsp和gln基因上游部分的序列具有多個(gè)TATA-box、CAAT-box,hsp上游序列含有11處TATA-box,18處CAAT-box;gln上游序列含有14處TATA-box、11處CAAT-box。hsp和gln上游序列中除了基本的轉(zhuǎn)錄起始元件TATA-box、CAAT-box之外,還存在著許多應(yīng)答元件如光響應(yīng)元件、缺氧誘導(dǎo)的調(diào)控元件、茉莉酸甲酯反應(yīng)調(diào)控元件和晝夜控制的調(diào)節(jié)元件(見圖5、6和表2)。hsp上游序列還具有冷反應(yīng)和脫水反應(yīng)的調(diào)控元件(1個(gè))、防御和應(yīng)激反應(yīng)中的作用元件(1個(gè))、脫落酸反應(yīng)作用元件(3個(gè))和MYB結(jié)合位點(diǎn)(4個(gè))。gln上游序列具有低溫反應(yīng)作用中的元件(2個(gè))、熱應(yīng)激反應(yīng)中的作用元件(1個(gè))、水楊酸反應(yīng)中的作用元件(1個(gè))、生長素反應(yīng)元件(1個(gè))和與分生組織相關(guān)的調(diào)控元件(2個(gè))。

    (楊樹Populustrichocarpa(XP_002312733.1)、PopulussimoniixPopulusnigra(ALJ94030.1)、可可Theobromacacao(XP_017975012.1)、酸棗Ziziphusjujube(XP_015888259.1)、麻瘋樹Jatrophacurcas(XP_012069490.1)、苧麻Boehmerianivea_1(AJI44225.1)、苧麻Boehmerianivea_2(AJD14836.1)、芝麻Sesamumindicum(XP_011090823.1)、胡蘿卜Daucuscarotasubsp.sativus(XP_017223067.1)、角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005712206.1)、龍須菜Gracilariopsislemaneiformis(KY971286)(本實(shí)驗(yàn))、Galdieriasulphuraria(XP_005705248.1)、Dixoniellagrisea_1(ADX97446.1)、Dixoniellagrisea_2(ADX97445.1)、細(xì)毛石花菜Gelidiumcrinale(AAK60408.1)、角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005717136.1)、角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005717133.1))
    圖4 基于gln氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹
    Fig.4 NJ tree based onglnamino acids

    2.4 龍須菜hsp、gln基因表達(dá)分析

    根據(jù)hsp、gln、18s、gapdh基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得此4個(gè)基因的擴(kuò)增效率分別為98.2%、100.4%、99.7%、101.0%,均接近100%且偏差在5%內(nèi),說明熒光定量引物合格可用。在龍須菜魯龍1號(hào)和981品系的發(fā)育過程中,hsp基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相似(見圖7),從Ⅰ~Ⅲ階段,hsp基因表達(dá)水平呈緩慢上升狀態(tài),到Ⅳ階段時(shí)表達(dá)水平出現(xiàn)驟然大幅升高(p<0.05);與981品系相比,魯龍1號(hào)品系hsp基因相對(duì)表達(dá)量增加更多。gln基因在龍須菜魯龍1號(hào)和981品系的發(fā)育過程中,表達(dá)水平的變化趨勢(shì)也十分相似(見圖8),從Ⅰ~Ⅱ階段呈上升趨勢(shì),從Ⅱ階段到Ⅳ階段基因表達(dá)水平下降,到Ⅳ階段使達(dá)到最低水平;魯龍1號(hào)Ⅱ階段到Ⅲ階段的gln基因的相對(duì)表達(dá)量下降更多(p<0.05)。

    圖5 hsp啟動(dòng)子部分序列分析Fig.5 Promoter analysis of hsp upstream sequence sequence

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)克隆得到了龍須菜hsp和gln基因,經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),兩基因的蛋白均不存在信號(hào)肽,為非分泌型蛋白。Hsp氨基酸序列的49~164 aa分析為HSP20的功能結(jié)構(gòu)域,此序列區(qū)與角叉菜最為相近。HSP20是熱休克蛋白(HSP)家族中平均分子量為20 kD的蛋白,作為分子伴侶在高溫下防止蛋白質(zhì)發(fā)生變性和聚集[22- 23]。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Hsp序列在物種間存在較大差異,全長166 aa的氨基酸序列上,共有8個(gè)保守位點(diǎn),均處于HSP20結(jié)構(gòu)域內(nèi),說明該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍坠δ艿闹匾饬x。Hsp的NJ進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),龍須菜的Hsp與杉藻科角叉菜的Hsp在進(jìn)化中處于不同的進(jìn)化分支上,而與放線菌、酵母、綠菌及星球蟲科Tetrasphaeraaustraliensis的Hsp處于同一進(jìn)化支中,發(fā)現(xiàn)Hsp在不同紅藻中的起源存在不同。

    Gln序列的65~144 aa處分析為谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域,與谷氨酰胺合成酶的生物合成、酶活性相關(guān),有助于谷氨酰胺合成酶結(jié)合底物[24]??缒^(qū)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Gln序列含有兩個(gè)跨膜區(qū)為(1~18 aa TMⅠ和47~69 aa TMⅡ),說明其為跨膜蛋白。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)29~41 aa為LCR。LCR是蛋白質(zhì)片段中重復(fù)出現(xiàn)一種或少數(shù)幾種氨基酸,氨基酸多樣性比較低[25]。LCR與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān),LCR在蛋白質(zhì)表面的含量隨蛋白質(zhì)半衰期的增長而增多[26]。Gln序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),TMⅠ、TMⅡ跨膜區(qū)、LCR均為龍須菜中特有的序列區(qū)域,這些特有的序列結(jié)構(gòu)可能是龍須菜在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的,使蛋白質(zhì)具有獨(dú)特的功能特征,如跨膜區(qū)可能使蛋白質(zhì)具有附于膜上的能力。比對(duì)結(jié)果中還發(fā)現(xiàn),雙子葉植物綱的Gln序列結(jié)構(gòu)相似,龍須菜的Gln序列與紅藻的序列結(jié)構(gòu)相似。這一結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹中將紅藻的Gln與雙子葉植物的Gln分為了2大類群,這說明紅藻與雙子葉植物的Gln在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了分歧,從而形成了2個(gè)進(jìn)化支,龍須菜的Gln處于紅藻Gln進(jìn)化支中與角叉菜Gln相近的位置。

    圖6 gln啟動(dòng)子部分序列分析Fig.6 Promoter analysis of gln upstream sequence

    圖7 龍須菜981和魯龍1號(hào)不同發(fā)育階段中hsp基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative analysis of hsp in different development stages of different Gp.lemaneiformis strains

    表2 啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件分析Table 2 Cis-acting regulatory elements analysis of promoter sequences of hsp and gln

    圖8 龍須菜981和魯龍1號(hào)不同發(fā)育階段中g(shù)ln基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative analysis of gln in different development stages of different Gp.lemaneiformis strains

    植物啟動(dòng)子包括核心元件和一般上游元件,分析發(fā)現(xiàn)獲得的gln和hsp基因上游均具有TATA-box和CAAT-box,這是絕大多數(shù)啟動(dòng)子正確啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的。TATA-box一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前25~30 bp的區(qū)域內(nèi),是RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn),保證轉(zhuǎn)錄的精確起始,并調(diào)控上游激活蛋白[27]。CAAT-box主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及其前面的150 bp范圍內(nèi),主要控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率,并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄,是啟動(dòng)子、增強(qiáng)子區(qū)域常見作用元件[28]。除了參與調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件,gln和hsp上游序列中還具有多種調(diào)節(jié)元件,2基因的表達(dá)均可能受光照、茉莉酸甲酯、厭氧和晝夜環(huán)境影響。植物激素對(duì)紅藻生殖發(fā)育具有調(diào)控作用,如精胺具有促進(jìn)蜈蚣藻果胞的成熟和釋放的作用[29-30];乙烯能夠促進(jìn)翼枝菜的四分孢子囊成熟[31]。通過上游序列分析發(fā)現(xiàn),gln基因表達(dá)可能受水楊酸、生長素的影響,而hsp基因的表達(dá)可能受MYB轉(zhuǎn)錄因子、脫落酸影響。有研究發(fā)現(xiàn)水楊酸、生長素、MYB、脫落酸轉(zhuǎn)錄因子均與植物生殖發(fā)育相關(guān),如水楊酸可抑制小蒼蘭種球的生長、推遲花期、減少小花數(shù)目[32];生長素對(duì)花分生組織的形成、雄蕊花絲發(fā)育、雌蕊心皮邊緣的軸向?qū)ΨQ和胎座框的發(fā)育相關(guān)[33-34];MYB 轉(zhuǎn)錄因子與胚軸細(xì)胞伸長、轉(zhuǎn)基因植株花瓣大小、花粉和花芽的發(fā)育等相關(guān)[35];脫落酸在植物的成花誘導(dǎo)、花芽分化及開花調(diào)控中也起著非常重要的作用[36],還參與多種果實(shí)發(fā)育的生理過程,如柿子(Diospyroskaki)[37]、柑橘(Citrusreticulata)[38]、櫻桃(Prunusspecies)[39]、葡萄(Vitisvinifera)[40]、草莓(Fragaria×ananassa)[41]。在昆布屬(Ecklonia)海藻的孢子中, 脫落酸(ABA)的含量隨季節(jié)的變化而變化[42]。因此,推測(cè)這些因素可能通過調(diào)控gln與hsp基因的表達(dá)來影響龍須菜的育性表現(xiàn),但這一推測(cè)仍需要進(jìn)一步的研究。

    基因表達(dá)水平檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)hsp基因在龍須菜不同品系發(fā)育的前3個(gè)階段處于緩慢升高的狀態(tài),到Ⅳ階段上升幅度突然增大。研究發(fā)現(xiàn),許多hsp家族成員參與生物體性成熟,如百合產(chǎn)生小孢子的減數(shù)分裂一期中,細(xì)胞核或染色體的變化可能有hsp70同源蛋白參與[43];釀酒酵母的減數(shù)分裂受啟動(dòng)子附近的熱休克元件相互作用誘導(dǎo)[44];在番茄花粉發(fā)育早期的造孢組織、小孢子和絨氈層前體中檢測(cè)到存在hsp70同源的mRNA和蛋白,hsp70同源蛋白儲(chǔ)存在成熟的花粉粒中[45];蘭州百合的hsp16.45可能幫助花粉母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞,在減數(shù)分裂的偶線期晚期到粗線期階段對(duì)抗極端溫度[46];hsp70同源蛋白mRNA的缺失可能是造成高粱細(xì)胞質(zhì)雄性不育的重要原因[47];在玉米花粉發(fā)育過程中的減數(shù)分裂前期和減數(shù)分裂期,hsp81在胚中大量表達(dá)[48]。龍須菜發(fā)育的Ⅳ階段特征為藻體表面四分孢子放散完畢,藻體便面出現(xiàn)大量孔洞,因此推測(cè)hsp在Ⅳ階段表達(dá)量特異性升高可能與四分孢子放散完畢后,藻體表面形成的大量傷口的修復(fù)相關(guān),但此推測(cè)還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。gln基因在龍須菜2個(gè)品系的發(fā)育過程中的Ⅱ階段表達(dá)水平最高,Ⅳ階段表達(dá)水平最低,Ⅰ階段和Ⅲ階段為變化的過渡階段。有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶與生物育性相關(guān)。谷氨酰胺合成酶在盤基網(wǎng)柄菌孢子母細(xì)胞中的活性比在柄細(xì)胞中的活性高約4倍,為谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育提供了證據(jù)[13];谷氨酰胺合成酶在水稻花粉成熟過程中起到重要作用,抑制谷氨酰胺合成酶活性,會(huì)使水稻圓錐花序中的氨積累,而導(dǎo)致水稻不育[13]等等。龍須菜在Ⅱ階段形成大量的四分孢子囊,并伴有少量的四分孢子放散現(xiàn)象;在Ⅳ階段孢子放散完畢,因此推測(cè)gln基因可能與龍須菜藻體表面大量四分孢子囊的形成相關(guān)。相比981品系,魯龍1號(hào)品系中hsp和gln基因的變化趨勢(shì)更加急劇,這可能與龍須菜兩品系不同的育性表現(xiàn)相關(guān),但這些推測(cè)均還需要后續(xù)研究工作繼續(xù)探究。

    致謝:特別感謝李曉東對(duì)本研究的貢獻(xiàn),完成了表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選及基因克隆工作。

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