松果菊苷通過上調(diào)miR-34a減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷

蔡華，張領(lǐng)，李滿生，李新峰

作者單位：1 467000 平頂山,河南省平頂山市第二人民醫(yī)院心內(nèi)三科

急性心肌梗死（AMI）為導(dǎo)致心血管病患者死亡的重要原因，挽救瀕死心肌的關(guān)鍵在于及時(shí)疏通梗死動(dòng)脈、恢復(fù)心肌血液供應(yīng)發(fā)現(xiàn)心肌缺血一定時(shí)間后恢復(fù)血流灌注會(huì)造成心肌損傷加重，易引起心肌頓抑、心功能不全、心律失常等，即為心肌缺血再灌注損傷（IRI）[1,2]。在及時(shí)恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流的同時(shí)如何避免IRI發(fā)生成為心臟缺血治療的難點(diǎn)。microRNAs（miRNAs）是一類由21～23個(gè)堿基組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過促進(jìn)mRNA降解或抑制mRNA翻譯來調(diào)控靶基因表達(dá)[3]。研究證實(shí)[4,5]，miRNAs在心血管系統(tǒng)中大量表達(dá)，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs在IRI中發(fā)揮重要作用，其中miR-34a具有調(diào)控心肌細(xì)胞纖維化、肥大、凋亡等作用，暗示miR-34a在IRI過程中發(fā)揮重要作用。松果菊苷（ECH）是從植物管花肉蓯蓉中提取出的苯乙醇苷類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧性損傷有顯著保護(hù)作用[6]。本研究利用H9c2心肌細(xì)胞模擬IRI，探討松果菊苷對(duì)心肌細(xì)胞IRI的保護(hù)作用及miR-34a表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑、儀器 鼠胚胎H9c2心肌細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫。注射用鹽酸地爾硫卓，規(guī)格：50 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20063738，購自浙江亞太藥業(yè)股份有限公司。松果菊苷（ECH）購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和0.05% EDTA-胰蛋白酶液均購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司；細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；MirVanaTM miRNA提取試劑盒購自美國Ambion公司；Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman Universal PCR Master Mix及miR-34a、U6引物購自美國Applied Biosystems公司。Bio-Rad 680酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；EPICSXL流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Couhe公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Beckman Couhe公司。

1.2 IRI模型建立 取出液氮凍存的心肌細(xì)胞后解凍復(fù)蘇，接種于含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于條件為37℃、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，更換成不含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于條件為37℃、95% N2、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)10 h；接著再次更換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于條件為37℃、5%CO2的孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)2 h。

1.3 含藥血清制備 挑選本室SD雄性大鼠36只，體重250±50 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽性藥物（鹽酸地爾硫卓）組以及松果菊苷低、中、高劑量組，每組6只。松果菊苷低、中、高劑量組大鼠分別通過尾靜脈注射2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg的ECH生理鹽水溶液，陽性藥物組大鼠通過尾靜脈注射1 mg/kg的鹽酸地爾硫卓溶液，對(duì)照組、模型組大鼠通過尾靜脈注射等量生理鹽水。各組大鼠給藥后1～1.5 h，經(jīng)股動(dòng)脈抽取血液，室溫靜止、離心得到血清，血清過濾除菌，56℃水浴滅活補(bǔ)體30 min，備用。

1.4 藥物處理 對(duì)照組心肌細(xì)胞用含10%對(duì)照血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組造模時(shí)用含10%對(duì)照血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；陽性藥物組造模時(shí)用含10%鹽酸地爾硫卓血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；ECH各處理組造模時(shí)用含10%對(duì)應(yīng)濃度的ECH血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將心肌細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，根據(jù)前述方法建立IRI模型；每孔加入20 μl 5 g/l的MTT磷酸緩沖液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心棄去上清，向每孔加入150 μl DMSO，振蕩20 min使結(jié)晶充分溶解；用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）。細(xì)胞存活率（%）=OD值（處理組）/OD值（對(duì)照組）×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 心肌細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，根據(jù)前述方法建立IRI模型；收集各組H9c2細(xì)胞，用0.01 mol/l磷酸緩沖液漂洗；加入100 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；接著加入5 μl Annexin V-FITC染色液，混勻后加入5 μl PI染色液，混勻，室溫避光放置15 min；加入400 μl 1×Binding Buffer，混勻后置于冰上；于1 h內(nèi)用EPICSXL流式細(xì)胞儀采集并分析數(shù)據(jù)。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH、CK、SOD、MDA含量測(cè)定 收集各組培養(yǎng)心肌細(xì)胞的上清液，2000 rpm離心20 min后取上清液，接著分別按照試劑盒說明書測(cè)定上清液中LDH、CK、SOD、MDA含量。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miRNA-34a水平 收集各組心肌細(xì)胞，按照MirVanaTM miRNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞miRNA，用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。取25 ng RNA，用Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。合成cDNA后，用Taqman Universal PCR Master Mix檢測(cè)miR-34a表達(dá)，首先配制20 μl qRT-PCR體系：10 μl Taqman Master Mix、1 μl Taqman miRNA assay Mix、1.5 μl cDNA、7.5 μl ddH2O；混勻后在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。選取U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCTCTU6）±SD；ΔΔCT =（ΔCT目的miRNAΔCTU6）±SD。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞存活率的影響 模型組、陽性藥物組和ECH各劑量組心肌細(xì)胞IRI后細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽性藥物組和ECH中、高劑量組心肌細(xì)胞存活率較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ECH低劑量組心肌細(xì)胞存活率較模型組亦升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ECH中、高劑量組心肌細(xì)胞存活率與陽性藥物組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞存活率的影響（n=5，±s）

表1 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞存活率的影響（n=5，±s）

注：ECH：松果菊苷；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05

組別 劑量（mg/kg） 細(xì)胞存活率（%）對(duì)照組 - 98.75±2.36模型組 - 68.04±3.86a陽性藥物組 1 82.35±5.17ab ECH低劑量組 2.5 73.16±4.30ac ECH中劑量組 5 78.32±4.78ab ECH高劑量組 10 82.13±5.05ab

2.2 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，模型組、陽性藥物組和ECH各劑量組心肌細(xì)胞IRI后細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽性藥物組和ECH中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ECH低劑量組心肌細(xì)胞凋亡率較模型組亦降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ECH高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率較陽性藥物組間顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、表2）。

圖1 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞凋亡的影響

表2 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞凋亡的影響（n=5，±s）

表2 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞凋亡的影響（n=5，±s）

注：ECH：松果菊苷；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05

組別 劑量（mg/kg） 細(xì)胞凋亡率（%）對(duì)照組 — 4.24±0.82模型組 — 34.05±4.18a陽性藥物組 1 17.88±3.13ab ECH低劑量組 2.5 27.91±5.16ac ECH中劑量組 5 18.04±4.95ab ECH高劑量組 10 12.06±3.02abc

2.3 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞生成LDH、CK、SOD、MDA的影響 模型組、陽性藥物組和ECH各劑量組心肌細(xì)胞IRI后生成LDH、CK、MDA量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），SOD活力較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。陽性藥物組和ECH中、高劑量組心肌細(xì)胞生成LDH、CK、MDA量較模型組顯著降低（P＜0.05），SOD活力較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）；ECH低劑量組心肌細(xì)胞生成LDH、CK、MDA量與模型組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SOD活力與模型組間的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ECH高劑量組心肌細(xì)胞生成LDH、CK、SOD、MDA與陽性藥物組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ECH中劑量組心肌細(xì)胞生成LDH、CK、SOD與陽性藥物組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

2.4 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞miRNA-34a表達(dá)水平的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，模型組、陽性藥物組和ECH各劑量組心肌細(xì)胞IRI后細(xì)胞miRNA-34a表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。陽性藥物組和ECH各劑量組心肌細(xì)胞miRNA-34a表達(dá)水平較模型組顯著升高（P＜0.05）。ECH中、高劑量組心肌細(xì)胞miRNA-34a表達(dá)水平與陽性藥物組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

3 討論

心肌IRI常發(fā)生在心臟缺血一段時(shí)間再次恢復(fù)血液供應(yīng)時(shí)，臨床癥狀為梗死面積擴(kuò)大、收縮舒張功能降低等，其發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，主要表現(xiàn)在能量代謝異常、Ca2+超載、氧自由基損傷等[1,2,7]。目前其防治方法集中在減小梗死面積上，但許多藥物與方法僅延遲了心肌損傷。ECH存在于大量抗衰老中藥中，如管花肉蓯蓉、馬先蒿、地黃、列當(dāng)、玄參等，尤其是管花肉蓯蓉中，其含量可高達(dá)30%，為這些中藥的重要抗衰老成份[6,8]。近期研究發(fā)現(xiàn)[9,10]，ECH主要具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)肝臟、改善免疫力及學(xué)習(xí)記憶等方面的作用，暗示ECH可能對(duì)心肌IRI具有一定的保護(hù)作用。

表3 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞生成LDH、CK、SOD、MDA的影響（n=5，±s）

表3 ECH對(duì)IRI心肌細(xì)胞生成LDH、CK、SOD、MDA的影響（n=5，±s）

注：ECH：松果菊苷；LDH：乳酸脫氫酶；CK：肌酸激酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05

組別 劑量（mg/kg） LDH（U/l） CK（U/l） SOD（U/l） MDA（μmol/l）對(duì)照組 — 23.85±4.26 14.96±2.26 47.65±5.43 1.54±0.46模型組 — 43.12±5.68a 31.22±6.45a 28.85±4.37a 5.82±0.78a陽性藥物組 1 31.24±4.45ab 22.58±5.13ab 40.18±4.02ab 2.75±0.63ab ECH低劑量組 2.5 39.27±5.41ac 28.84±5.25a 33.18±4.45ac 4.95±0.71ac ECH中劑量組 5 34.83±4.24ab 24.13±3.85ab 35.96±4.34ab 4.07±0.67abc ECH高劑量組 10 30.87±4.02ab 21.09±3.71ab 37.04±5.12ab 2.98±0.58ab

表4 各組心肌細(xì)胞miRNA-34a的相對(duì)表達(dá)水平（n=5，±s）

表4 各組心肌細(xì)胞miRNA-34a的相對(duì)表達(dá)水平（n=5，±s）

注：ECH：松果菊苷；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05

組別 劑量（mg/kg） miRNA-34a對(duì)照組 — 1.77±0.26模型組 — 3.24±0.32a陽性藥物組 1 5.15±0.38ab ECH低劑量組 2.5 4.06±0.44abc ECH中劑量組 5 4.83±0.32ab ECH高劑量組 10 5.08±0.45ab

本研究發(fā)現(xiàn)ECH預(yù)處理的心肌細(xì)胞經(jīng)過IRI后，較模型組表現(xiàn)出更多的細(xì)胞存活、更少的細(xì)胞凋亡，且中劑量ECH的作用效果與陽性藥物鹽酸地爾硫卓相當(dāng)，說明ECH對(duì)心肌細(xì)胞IRI后具有良好的保護(hù)能力。心肌梗死發(fā)生時(shí)，缺氧可造成ATP產(chǎn)生減少、自由基生成卻過多，進(jìn)而引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、膜蛋白變性以及DNA損傷[11,12]。細(xì)胞內(nèi)清除自由基的主要酶為SOD，其在心肌IRI時(shí)受到明顯抑制，造成自由基大量積累，同時(shí)造成心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物MDA生成過多，從而引發(fā)細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜被破壞后，LDH、CK從細(xì)胞中釋放，因此細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH、CK含量可體現(xiàn)出心肌細(xì)胞的損傷程度[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組心肌細(xì)胞LDH、CK釋放量加大，而ECH和鹽酸地爾硫卓可促進(jìn)SOD表達(dá)，促進(jìn)氧自由基的清除，抑制了MDA的大量產(chǎn)生，從而減輕胞膜損傷、減少LDH和CK的外流，進(jìn)一步證實(shí)ECH可保護(hù)心肌細(xì)胞IRI時(shí)的損傷程度。

miRNA在動(dòng)植物界廣泛存在，為細(xì)胞病生理活動(dòng)必不可少的調(diào)節(jié)器，可經(jīng)過識(shí)別靶mRNA 3’UTR結(jié)構(gòu)域與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶mRNA翻譯并促進(jìn)其降解，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miRNA在病理生理方面的作用決定了其可能為調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的重要分子[3,4,15]。研究發(fā)現(xiàn)[5,16,17]，miRNA與心室重塑、心力衰竭過程有關(guān)，如miR-34a、miR-21、miR-133等。miR-34a屬于miR-34家族（包括miR-34a、miR-34b、miR-34c），位于lp36上，是被p53直接調(diào)控的miRNA分子，Bcl-2是其直接靶基因。研究發(fā)現(xiàn)[18-20]，miR-34a既能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡起到抗癌作用，又能在心肌IRI過程中減少心肌細(xì)胞凋亡而減輕心肌損傷。miR-34a可通過作用于p53、Notch、Wnt等信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化，有研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-34a可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、纖維化、凋亡，抑制miR-34a可減少心肌細(xì)胞肥大、纖維化、凋亡，有助于改善心室重塑，這一步體現(xiàn)了miR-34a功能的雙重性。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞IRI后生成LDH、CK、MDA量較對(duì)照組顯著升高，SOD活力較對(duì)照組顯著降低，說明心肌細(xì)胞IRI后出現(xiàn)明顯損傷。陽性藥物組和ECH中、高劑量組心肌細(xì)胞生成LDH、CK、MDA量較模型組顯著降低，SOD活力較對(duì)照組顯著升高，說明ECH可減輕心肌細(xì)胞IRI后的損傷程度。心肌細(xì)胞IRI后細(xì)胞miRNA-34a表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，而ECH或鹽酸地爾硫卓預(yù)處理過的心肌細(xì)胞miRNA-34a表達(dá)水平較模型組顯著更高，這表明ECH對(duì)心肌細(xì)胞IRI的保護(hù)機(jī)制可能與miR-34a表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ECH可顯著提高IRI后心肌細(xì)胞的存活率、降低其凋亡率，上調(diào)miR-34a表達(dá)，說明ECH對(duì)心肌細(xì)胞IRI后具有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能與miR-34a表達(dá)上調(diào)有關(guān)。然而心肌IRI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，ECH的具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步探究。