基于實(shí)時(shí)熒光定量監(jiān)測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV/Friend感染方法的建立與評(píng)價(jià)

宋姝庭，孫 麗，蔣金鳳，黃 海，王建華

(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海 200031)

MuLV/Friend感染小鼠模型的建立，在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒致病機(jī)制、抗病毒策略評(píng)價(jià)，以及腫瘤的發(fā)生中具有重要的意義。MuLV/Friend感染急性階段，血液中病毒載量快速上升，引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)以抑制病毒復(fù)制，隨后，感染進(jìn)入慢性階段，在此過(guò)程中，病毒整合到宿主基因組中[7]。由于MuLV/Friend與人類免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)病毒復(fù)制特性及急性臨床癥狀相似，MuLV/Friend感染的小鼠艾滋病模型被用來(lái)研究機(jī)體抗逆轉(zhuǎn)錄病毒免疫機(jī)制，以及用于體內(nèi)評(píng)價(jià)抗HIV-1藥物的安全性和有效性[8]，且因?yàn)镸uLV/Friend在慢性感染階段會(huì)誘發(fā)腫瘤，這一模型也被廣泛地應(yīng)用到探討腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及評(píng)價(jià)治療策略等方面[4,9-10]。

目前，對(duì)于檢測(cè)病毒的復(fù)制主要采用計(jì)算病毒感染導(dǎo)致的脾腫大指數(shù)(splenic index,SI)的方法[11]，該方法不能實(shí)時(shí)、精確地定量病毒復(fù)制及在其它組織中的分布。本研究中，我們建立了一種基于實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR[12]的病毒復(fù)制檢測(cè)方法，可用于實(shí)時(shí)定量小鼠各組織內(nèi)病毒載量，為利用MuLV/Friend小鼠感染模型研究抗逆轉(zhuǎn)錄病毒策略或宿主免疫等，提供一種特異、快速、靈敏的監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制的手段。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MuLV/Friend病毒感染6～8周齡♀ BALB/c小鼠，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK(滬)2013-0018。實(shí)驗(yàn)獲得中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所動(dòng)物倫理批件(IPS動(dòng)倫審第2013014號(hào))。

1.2試劑與儀器戊巴比妥鈉(上海隆盛公司)；TRIzol試劑(Life Technologies公司)；三氯甲烷、異丙醇(上海滬試公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)；DNA聚合酶(Vazyme公司)；T4 DNA連接酶(NEB公司)；PMD-19T載體(TaKaRa公司)；快速質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN公司)；qRT-PCR TaqMan試劑盒(康為世紀(jì)公司)。Prism7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3qRT-PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建MuLV/Friend病毒株由廣州中醫(yī)藥大學(xué)符林春教授惠贈(zèng)。TRIzol試劑提取病毒基因組RNA，利用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；擴(kuò)增病毒gag區(qū)域，連入PMD-19T載體，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；利用Nanodrop測(cè)量質(zhì)粒濃度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分子量，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。擴(kuò)增gag使用上游引物序列為5′-CTCTTTCTCCGAGGACCCAG-3′，下游引物序列為5′-GTCATTGGGCAGCTGAGTTG-3′，合成特異性熒光探針，探針序列為5-Carboxyfluorescein(5-FAM)-ACAGCTTTGATCGAGTCCGTTCTCCT-Carboxytetramethylrhodamine(TAMRA-3)。gag擴(kuò)增條件為：95℃，10 min，預(yù)變性；95℃，15 s，變性；60℃，1 min，退火/延伸，40個(gè)循環(huán)。

1.4BALB/c小鼠感染、組織RNA的抽取及病毒載量檢測(cè)6～8周齡BALB/c小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。BALB/c小鼠腹腔接種MuLV/Friend;感染2、4、5、7、10、12、16、20、28 d后，戊巴比妥鈉安樂(lè)死，小鼠解剖后獲取各組織。將組織充分研磨，50 mg組織加入1 mL TRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置10 min，待組織充分裂解；加入200 μL三氯甲烷，搖晃15 s，室溫靜置10 min，液體分層； 4℃、12 000×g離心10 min；將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，加入500 μL異丙醇，上下顛倒6～8次，室溫靜置10 min；4℃、12 000×g離心10 min，棄上清，加1 mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇；4℃、12 000×g離心5 min，棄上清，待沉淀干燥后，加入適量DEPC水溶解抽提的RNA，并利用Nanodrop測(cè)量RNA濃度。利用上述條件，qRT-PCR擴(kuò)增病毒gag區(qū)域，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量各組織內(nèi)病毒載量。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建利用DNA聚合酶試劑盒擴(kuò)增病毒gag區(qū)域，連入PMD-19T載體，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；Nanodrop測(cè)量質(zhì)粒濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分子量，計(jì)算出質(zhì)?？截悢?shù),標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍比稀釋，共7個(gè)濃度梯度(Tab 1)。在擴(kuò)增反應(yīng)中，qRT-PCR儀檢測(cè)gag區(qū)域探針熒光信號(hào)，并獲得各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值(Tab 1)，該Ct值與各濃度標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的Log值可構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(Fig 1A)，能夠?qū)uLV/Friend病毒進(jìn)行定量。核酸電泳驗(yàn)證目的擴(kuò)增條帶的分子量(Fig 1B)；以水為模板作陰性對(duì)照，擴(kuò)增所得Ct值為34.3，高于稀釋10-10倍的標(biāo)準(zhǔn)品Ct值，因此，利用該建立的qRT-PCR方法，最低可以監(jiān)測(cè)到10-9倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，其對(duì)應(yīng)的MuLV/Friend拷貝數(shù)為1.54×105copies·L-1。該檢測(cè)方法具有較高的靈敏度。

Tab 1 Serial dilution of MuLV/Friend gag standard substanceand summary of Ct values from real-time quantitative RT-PCR

2.2急性感染階段各組織中病毒分布監(jiān)測(cè)為分析急性感染階段MuLV/Friend在各組織器官內(nèi)的分布情況，BALB/c小鼠腹腔接種1×109拷貝數(shù)的病毒，感染14 d后，戊巴比妥鈉安樂(lè)死，解剖后取小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸道、胸腺、腦、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、腸系膜淋巴結(jié)、payers’淋巴結(jié)、血清和白細(xì)胞，利用建立的qRT-PCR法，檢測(cè)各組織器官中g(shù)ag區(qū)域的Ct值，并將所得Ct值引入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算可得各組織器官中的病毒載量拷貝數(shù)。感染14 d，發(fā)現(xiàn)明顯的脾腫大(Fig 2A)，并發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、肺、腎、腸道、胸腺、腦、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、腸系膜淋巴結(jié)、payers’淋巴結(jié)、血清和白細(xì)胞中，均有不同程度的病毒復(fù)制，而血液和脾臟中病毒載量高于其他組織(Fig 2B)。結(jié)果表明，感染后14 d，病毒已建立了系統(tǒng)感染，且病毒在血液和脾臟中復(fù)制較高。

Fig 1 Establishment of standard curve for real-timequantitative reverse transcription PCR assay

2.3急性感染階段血液和脾臟中病毒復(fù)制的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)MuLV/Friend急性感染期病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)，我們分析了急性階段脾臟和血液中病毒載量的動(dòng)態(tài)變化。BALB/c小鼠腹腔接種1×109拷貝數(shù)的病毒，分別感染2、4、5、7、10、12、16、20、28 d，每組3只小鼠，戊巴比妥鈉安樂(lè)死，解剖后取小鼠的血液和脾臟，利用qRT-PCR檢測(cè)法檢測(cè)血液和脾臟中的gag區(qū)域的Ct值，并將所得Ct值引入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算后得血液和脾臟中MuLV/Friend的拷貝數(shù)(Fig 3)。結(jié)果表明，在感染10 d時(shí)，病毒載量達(dá)到了頂峰，隨即下降。

Fig 2 Viral distribution in tissues(n=8)

BALB/c mice were infected via i.p. with MuLV/Friend for 14 d,and the splenomegaly was observed (A). a:mock (PBS) infection;b:virus infection. Viral loads in multiple tissues were quantified (B).

Fig 3 Dynamic kinetics of virus replication

Viral loads in blood and spleen were quantified at the indicated time of post-infection.

3 討論

MuLV/Friend是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能引起小鼠紅白細(xì)胞血癥，其發(fā)病過(guò)程與HIV-1引起的人類免疫缺陷綜合癥相似，常用于感染小鼠建立小鼠艾滋病模型，研究宿主抗病毒反應(yīng)和評(píng)價(jià)抗病毒策略[9]。感染初期，MuLV/Friend能促使紅系祖細(xì)胞在不依賴紅細(xì)胞生長(zhǎng)素情況下在脾臟中大量分化，形成紅細(xì)胞，導(dǎo)致脾臟腫大[5-6,13]。感染后期，會(huì)使原癌基因和抑癌基因發(fā)生突變，誘發(fā)腫瘤[11]。傳統(tǒng)方法主要通過(guò)計(jì)算脾腫大指數(shù)檢測(cè)病毒復(fù)制，但敏感度不夠高，結(jié)果不夠精確，需要建立一種靈敏度更高，且操作簡(jiǎn)便的方法檢測(cè)MuLV/Friend 的感染復(fù)制。因此，我們構(gòu)建了基于qRT-PCR的方法，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)MuLV/Friend的復(fù)制。本研究通過(guò)構(gòu)建MuLV/Friend病毒標(biāo)準(zhǔn)品，并設(shè)計(jì)病毒gag區(qū)域特異性探針，利用qRT-PCR，最低可監(jiān)測(cè)到1.54×105copies·L-1的MuLV/Friend 病毒，相較于過(guò)去計(jì)算病毒導(dǎo)致脾腫大指數(shù)的方法，更為直接和精確，操作也相對(duì)簡(jiǎn)便，為定量分析MuLV/Friend復(fù)制提供了有效手段。利用該方法檢測(cè)感染后d 14各組織器官的病毒載量，發(fā)現(xiàn)脾臟和血液中的病毒載量高于其他組織，說(shuō)明脾臟和血液是MuLV/Friend主要復(fù)制位點(diǎn)，提示在分析MuLV/Friend急性感染動(dòng)力學(xué)中，應(yīng)更多關(guān)注脾臟和血液中的病毒復(fù)制狀況。監(jiān)測(cè)MuLV/Friend急性感染期脾臟和血液中的病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)曲線，發(fā)現(xiàn)病毒載量在感染d 10最高，隨后下降,這與之前文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7,14]，也說(shuō)明了該方法的可靠性。

借助MuLV/Friend感染小鼠模型，可研究逆轉(zhuǎn)錄病毒感染初期宿主免疫反應(yīng)。利用該模型已分析了 CD4+、CD8+T細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞在感染中的作用，如CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ可以抑制病毒復(fù)制；CD4+輔助型T細(xì)胞和濾泡輔助型T細(xì)胞可以增加細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)反應(yīng)，促使B細(xì)胞產(chǎn)生中和性抗體[7-8,15]。利用MuLV/Friend感染小鼠模型分析逆轉(zhuǎn)錄病毒急性感染階段的宿主免疫反應(yīng)，與猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)感染非人靈長(zhǎng)類模型以及病人取材相比，更具有可控性、方便性，因此，這一模型在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染研究中具有重要的應(yīng)用意義。

(致謝：感謝廣州中醫(yī)藥大學(xué)符林春教授惠贈(zèng)MuLV/Friend病毒株。)