miR-125a-5p通過PI3K/Akt/MMP信號通路抑制乳腺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移

楊玉玲，王照巖，楊志一，李洪利，尹崇高，劉雨清

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室、2.醫(yī)學(xué)研究實驗中心、3.護理學(xué)院，山東 濰坊 261053)

最近研究表明，microRNAs在惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中所起的作用是一個復(fù)雜的過程[1]，在此過程中涉及多種通路，如JAK/STAT、PI3K/Akt/mTOR、PI3K/Akt/MMP途徑，其中PI3K/Akt通路與多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)，如胰腺癌[2]、肝癌[3]等。先前研究表明，miR-125a-5p靶向調(diào)控GRB相關(guān)蛋白2(GRB-associated binding protein 2，GAB2)影響乳腺癌的遷移能力[4]，并且也證明GAB2通過PI3K/Akt/MMP通路，促進乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[5]，但是關(guān)于miR-125a-5p是否通過PI3K/Akt/MMP途徑抑制乳腺的侵襲與轉(zhuǎn)移，目前尚未有研究。本實驗主要通過改變miR-125a-5p和GAB2在乳腺癌細胞中的表達水平，探討miR-125a-5p抑制乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012-2017年的乳腺癌組織及其癌旁相對正常組織(>5 cm)各85例作為研究對象。這些病理組織已經(jīng)確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，根據(jù)WHO標準進行分級，患者均為女性，術(shù)前未經(jīng)過任何化療和放療，年齡30～70歲，臨床資料完整。所有85例乳腺癌患者均簽署知情同意書。

1.1.2試劑與細胞株 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、β-actin抗體，均購自Cell Signaling Technology公司；質(zhì)粒均由吉凱基因構(gòu)建合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit、PCR試劑盒SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit，均購自TaRaKa公司；Transwell小室購自Corning公司；Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MDA-MB-231(MDA231)、MCF-7購自ATCC。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)，雙垂直電泳槽(Bio-Rad公司)，Bio-Tek酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 參照文獻[6]操作，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒濃度0.761 9 g·L-1，轉(zhuǎn)染48 h，分組如下：① MDA231/NC(negative control)組：轉(zhuǎn)入過表達對照質(zhì)粒；② MDA231/miR-125a-5p組：轉(zhuǎn)入miR-125a-5p過表達質(zhì)粒；③ MDA231/Con+miR-125a-5p組：共轉(zhuǎn)染GAB2過表達對照質(zhì)粒和miR-125a-5p過表達質(zhì)粒；④ MDA231/GAB2+miR-125a-5p：共轉(zhuǎn)染GAB2過表達質(zhì)粒和miR-125a-5p過表達質(zhì)粒。

1.2.2Western blot實驗 各組轉(zhuǎn)染后細胞加入裂解液，提取蛋白。進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別孵育一抗、二抗。所用抗體濃度：β-actin(1 ∶1 000)，MMP-2、MMP-9、p-Akt、Akt(1 ∶500)。所得的條帶用ImageJ進行灰度值掃描。

1.2.3熒光定量PCR檢測 提取MCF-10A、MDA231、MCF-7細胞以及85例組織的RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，進一步進行qRT-PCR。miR-125a-5p的上游引物：5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游引物:5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,以U6作為內(nèi)參，莖 環(huán) 結(jié) 構(gòu): GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAG。進行qRT-PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s 1個循環(huán)，95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。共有85例病理組織，將所得的結(jié)果分為miR-125a-5p高表達組(高于中位數(shù))和miR-125a-5p低表達組(低于中位數(shù))。

1.2.4Transwell侵襲實驗 轉(zhuǎn)染后48 h，處理細胞，取3.5×104個細胞滴入上室，下室加入500 μL胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定20 min，Giemsa染色40 min，實驗重復(fù)3次。隨機取 5 個視野進行拍照、計數(shù)，計算平均值，實驗獨立重復(fù) 3 次。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對實驗結(jié)果進行分析，計量資料采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料之間的比較采用χ2檢驗，多組比較使用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1miR-125a-5p在乳腺癌組織中的表達及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系應(yīng)用qRT-PCR檢測85例病理組織中miR-125a-5p的表達量。Tab 1結(jié)果顯示，miR-125a-5p低表達者為51例(低于中位數(shù))，高表達者34例(高于中位數(shù))。其中，miR-125a-5p的表達水平與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)和組織學(xué)分期有關(guān)(P<0.05)，而與其他病理參數(shù)，如年齡、腫瘤大小、孕激素受體(PR)無關(guān)。

Tab 1 Relationship between miR-125a-5p expression andclinicopathologic parameters in 85 breast cancer patients

PR: Progesterone receptor;ER: Estrogen receptor.

2.2miR-125a-5p在乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達應(yīng)用qRT-PCR檢測細胞中miR-125a-5p的表達水平。Fig 1結(jié)果顯示，miR-125a-5p在MDA231和MCF-7細胞中表達水平比MCF-10A細胞明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Expression levels of miR-125a-5p in MCF-10,MCF-7 and MDA231 cells n=3)

*P<0.05vsMCF-10A

2.3miR-125a-5p抑制乳腺癌細胞侵襲能力Transwell侵襲實驗檢測miR-125a-5p對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。如Fig 2所示，與MDA231/NC細胞組相比，用EGF刺激后，MDA231/miR-125a-5p細胞組穿過基膜小孔的細胞數(shù)減少(P<0.05)；與MDA231/Con+miR-125a-5p細胞組相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p細胞組穿過基膜小孔的細胞數(shù)增加(P<0.05)。結(jié)果表明，miR-125a-5p抑制乳腺癌細胞的侵襲能力。

2.4miR-125a-5p降低Akt的磷酸化水平Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，用EGF刺激后，與MDA231/NC細胞組相比，MDA231/miR-125a-5p細胞組p-Akt水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MDA231/Con+miR-125a-5p細胞組相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p細胞組p-Akt水平明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5miR-125a-5p下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，用EGF刺激后，與MDA231/NC細胞組相比，MDA231/miR-125a-5p細胞組MMP-2和MMP-9的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MDA231/Con+miR-125a-5p細胞組相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p細胞組MMP-2和MMP-9表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，miR-125a-5p下調(diào) MMP-2和MMP-9蛋白的表達。

Fig 2 miR-125a-5p inhibited invasion of

Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1EGF. A: Representative images of penetrated cells with EGF stimulation;B, C: Quantification analysis of Transwell invasion assay on cells.*P<0.05vsMDA231/NC or MDA231/Con+miR-125a-5p.

3 討論

乳腺癌是女性癌癥死亡的首要原因，在其早期階段通常沒有致命性，但發(fā)生轉(zhuǎn)移后，患者的死亡率將會升高[7]。因此，研究乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。miRNAs是一類長約18～25個的核苷酸序列，它通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)作用，發(fā)揮其功能[8]。近年來對于miR-125a-5p的研究更加深入，并且發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。Zhu等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p能夠作為評估非小細胞性肺癌疾病進展和預(yù)后的一種重要指標。Banerjee等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p參與炎癥的發(fā)生，影響巨噬細胞的功能。本實驗發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p的表達與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)有關(guān)，熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在MDA231和MCF-7細胞的表達量明顯下降，Transwell結(jié)果顯示 miR-125a-5p抑制乳腺癌細胞的侵襲能力。

Fig 3 Expression of miR-125a-5p affected phosphorylation level ofAkt through EGF stimulation n=3)

Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1EGF. Expressions of Akt and p-Akt were detected by Western blot.*P<0.05vsMDA231/NC(+) or MDA231/Con+miR-125a-5p(+).

Fig 4 miR-125a-5p down-regulated expression of

Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1EGF. Expressions of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot.*P<0.05vsMDA231/NC(+) or MDA231/Con+miR-125a-5p(+).

先前研究表明，miR-125a-5p可通過與其靶蛋白GAB2結(jié)合，從而抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，而GAB2可與PI3K作用，進而活化Akt，且該信號通路廣泛存在于細胞中。Tang等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p可通過PI3K/Akt/mTOR抑制肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p能夠通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制乳腺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

許多研究表明miR-125a-5p在惡性腫瘤中低表達，如肝癌[12]、胃癌[13]等。先前的研究結(jié)果提示，miR-125a-5p在惡性腫瘤中主要發(fā)揮抑癌基因的作用。其中，GAB2作為miR-125a-5p的靶蛋白，GAB2與MMP-2和MMP-9的表達呈正相關(guān)，GAB2可調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達[14]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中，上調(diào)miR-125a-5p的表達水平可引起MMP-2和MMP-9表達的下調(diào)[6]。本實驗結(jié)果顯示，MDA231/miR-125a-5p細胞組中MMP-2和MMP-9的表達量下降，而在MDA231/GAB2+miR-125a-5p細胞組中，MMP-2和MMP-9表達量明顯升高。結(jié)果表明，miR-125a-5p下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達。

綜上所述，miR-125a-5p在乳腺癌中低表達，miR-125a-5p可通過PI3K/Akt信號通路下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，從而抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。這將會加深對乳腺癌的研究。

(致謝：本實驗是在濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心完成，非常感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)