苦參堿聯(lián)合黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺炎的影響

王 芳，孫耀貴，尹 偉，范闊海，段智變，孫 娜，李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

苦參堿和黃芩苷分別是從苦參和黃芩中提取的天然化合物，二者分別屬于生物堿類和黃酮類。已有大量文獻(xiàn)表明苦參堿和黃芩苷均具有抗炎作用，如Wu等[1]的研究已證明苦參堿可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的腸炎和氧化應(yīng)激，抑制炎癥因子白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)的分泌，且已證實(shí)是通過(guò)CCR7通路發(fā)揮其抗炎作用。黃芩苷能明顯減弱滑膜組織中成纖維細(xì)胞的增殖及炎性損傷程度，降低滑膜組織中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)的表達(dá)[2]，也可以有效減輕肝損傷引起的氧化應(yīng)激和炎癥因子的產(chǎn)生[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，苦參堿對(duì)豬藍(lán)耳病毒和圓環(huán)病毒共感染引起的小鼠間質(zhì)性肺炎有緩解作用[4]。雖然研究已表明苦參堿[5]和黃芩苷[6]有抑制肺炎作用，但對(duì)二者的聯(lián)合作用并未進(jìn)行研究。聯(lián)合用藥可以提升藥效或減少用藥量，并可通過(guò)作用多靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮藥效，降低抗藥性。本實(shí)驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)的小鼠肺炎為模型，考察苦參堿和黃芩苷聯(lián)合用藥的效果，為苦參堿和黃芩苷組方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)♀昆明小鼠(合格證號(hào)：11400777254421)，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下(溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70 %，12 h光/暗周期)，通風(fēng)良好的動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)前7 d，小鼠自由采食，以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2藥物與試劑 LPS(大腸桿菌055 ∶B5)購(gòu)自Solarbio公司；苦參堿和黃芩苷購(gòu)自南京澤朗生物科技有限公司，濃度≥98%。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司；小鼠白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒，購(gòu)于上海藍(lán)基生物科技有限公司；TRIzol試劑盒購(gòu)于Biomiga公司；兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；DNA Marker購(gòu)于中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器 ND-1000核酸蛋白濃度測(cè)定儀(美國(guó)NanoDrop)；DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀(北京市六一儀器廠)；7500定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；UV 2800雙光束紫外分光光度計(jì)(上海奧譜勒儀器有限公司)；Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

1.2方法

1.2.1藥物配制 稱取適量的苦參堿和黃芩苷，用DMEM培養(yǎng)基將苦參堿和黃芩苷溶解到終濃度為30 mg·kg-1和200 mg·kg-1，然后將二者的混合物進(jìn)行連續(xù)的2倍稀釋，配成中劑量和低劑量。之后將配好的藥物溶液置37℃水浴鍋備用。

1.2.2動(dòng)物分組與模型制備 將42只小鼠隨機(jī)分為7組(n=6)，具體分組為：空白組、LPS組、苦參堿(30 mg·kg-1)組、黃芩苷(200 mg·kg-1)組、聯(lián)合高劑量組(苦參堿30 mg·kg-1+黃芩苷200 mg·kg-1)、聯(lián)合中劑量組(苦參堿15 mg·kg-1+黃芩苷100 mg·kg-1)、聯(lián)合低劑量組(苦參堿7.5 mg·kg-1+黃芩苷50 mg·kg-1)。采用腹腔注射LPS的方法制備小鼠肺炎模型。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射LPS 20 mg·kg-1(0.01 mL·g-1)，空白組腹腔注射等體積的PBS。加藥組于造模后30 min腹腔注射藥物，空白組和LPS組腹腔注射等體積的DMEM。LPS刺激24 h后，摘眼球放血致死，采集全肺。

1.2.3肺組織病理學(xué)觀察 取左肺大葉組織，切兩半，用苦味酸溶液固定24 h后，脫水、透明、石蠟包埋，行5 μm厚切片，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察小鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4血清TNF-α、IL-6的測(cè)定 眼球取血后，4℃過(guò)夜，3 000 r·min-1、4℃離心10 min，收集血清，于-80 ℃保存。采用ELISA法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-6濃度。終止反應(yīng)后，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀槽內(nèi)，選擇450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，確定標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照區(qū)域，檢測(cè)相應(yīng)的光密度(optical density，OD)值，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相應(yīng)的濃度。

1.2.5qPCR測(cè)定小鼠肺組織中IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)量 取-80℃凍存的右下肺組織放到研缽中，充分碾磨后，加入1 mL裂解液，按步驟提取總RNA，測(cè)定樣品A260/A230和A260/A280。反轉(zhuǎn)錄后使用qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，引物序列見(jiàn)Tab 1。采用ΔΔCt法，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)各樣本IL-6、TNF-α mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析，計(jì)算RQ值(2-ΔΔCt)。

Tab 1 Primer sequences and product size

1.2.6小鼠肺組織MPO活性測(cè)定 采用MPO檢測(cè)試劑盒。取右上肺，肺組織稱重，剪切，勻漿。對(duì)照管加3 mL雙蒸水、0.2 mL試劑四、0.2 mL樣本；測(cè)定管加3 mL顯色劑、0.2 mL試劑四和0.2 mL樣本?；靹?，37℃水浴30 min。之后，每管加0.05 mL試劑七?；靹?，60 ℃水浴10 min，取出后立即在460 nm處，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。并根據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)MPO活性進(jìn)行分析。計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果

2.1小鼠一般情況空白組小鼠表現(xiàn)正常，活潑，反應(yīng)靈敏；模型組小鼠腹腔注射LPS后，反應(yīng)變遲鈍，行動(dòng)緩慢，飲食減少，被毛豎起，呼吸加快，全身顫抖，抱團(tuán)。各給藥組與LPS組小鼠相比，精神狀態(tài)較好，活動(dòng)量增多，飲食量也增加，整體狀態(tài)比LPS組好。

2.2肺組織切片病理形態(tài)學(xué)變化Fig 1的小鼠肺組織切片HE染色顯示，空白組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無(wú)分泌物和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁厚度正常。LPS組小鼠肺組織病變嚴(yán)重，發(fā)生實(shí)變，結(jié)構(gòu)不清晰，肺泡腔里有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔增厚，血管充血。給藥組與LPS組相比，肺組織病變明顯改善，肺泡壁變薄，肺泡腔炎性細(xì)胞減少，充血現(xiàn)象也有所減輕，與空白組相比肺泡壁仍厚。

2.3各處理組對(duì)小鼠血清IL-6、TNF-α水平的影響如Fig 2所示，與空白組相比，LPS組血清中IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)，各給藥組與空白組相比，IL-6和TNF-α水平?jīng)]有明顯差異。與LPS組相比，各給藥組IL-6水平差異無(wú)顯著性，但是有降低趨勢(shì)；黃芩苷組、聯(lián)合高、中劑量組與LPS組相比，TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，而苦參堿組和聯(lián)合低劑量組與LPS組相比TNF-α水平差異無(wú)顯著性，但有降低趨勢(shì)。各用藥組間相比，IL-6和TNF-α水平差異無(wú)顯著性。

Fig 1 Observation of histopathological changes in lungtissues of different treatment groups (×400)

Fig 2 Effects of different treatment on IL-6 andTNF-α secretion in serum n=6)

1：Control group;2:LPS group;3:Matrine group;4:Baicalin group;5:Combined high dose group;6:Combined medium dose group;7: Combined low dose group.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

2.4各處理組對(duì)小鼠肺組織IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，與空白組比較，LPS組IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。與LPS組相比，各給藥組均明顯降低IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量(P<0.01)，且各用藥組間相比，IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量差異無(wú)顯著性。

Fig 3 Effects of different treatment on IL-6 and TNF-α mRNAexpression of lung tissues n=6)

1：Control group;2:LPS group;3:Matrine group;4:Baicalin group;5:Combined high dose group;6:Combined medium dose group;7: Combined low dose group.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS group.

2.5各處理組對(duì)小鼠肺組織MPO活性的影響如Fig 4所示，與空白組比較，LPS組MPO活性明顯升高(P<0.01)；與LPS組相比，各給藥組均明顯降低肺組織MPO活性(P<0.05，P<0.01)，且各用藥組間差異無(wú)顯著性。

Fig 4 Effects of different treatment on MPOactivities of lung tissues n=6)

1：Control group;2:LPS group;3:Matrine group;4:Baicalin group;5:Combined high dose group;6:Combined medium dose group;7: Combined low dose group.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

3 討論

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床上最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，主要發(fā)生在肺泡和肺實(shí)質(zhì)，以肺水腫為主要特征，急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是其嚴(yán)重形式[7]。很多研究者通過(guò)LPS制備肺炎模型，LPS進(jìn)入機(jī)體后，可以使肺組織中大量炎性細(xì)胞趨化、遷移，最終發(fā)生浸潤(rùn)，引起炎性介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)，最終導(dǎo)致ALI。Zeng等[8]用LPS制備的小鼠肺炎模型，表現(xiàn)為肺泡隔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以嗜中性粒細(xì)胞為主，肺泡間隔出現(xiàn)不同程度的增厚，血管充血。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射LPS制備小鼠肺炎模型，病理學(xué)觀察顯示，與空白組相比，模型組小鼠表現(xiàn)出特征性的肺組織病變，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血，肺泡間隔增厚，成功建立了小鼠肺炎模型。用藥組與LPS組相比，肺部炎癥均有所改善，肺組織肺泡間隔變薄，充血現(xiàn)象減輕，說(shuō)明黃芩苷、苦參堿及其二者的聯(lián)合均表現(xiàn)出很好的抗炎作用。

在ALI中，LPS可誘導(dǎo)大量的炎癥因子產(chǎn)生，并參與肺損傷的進(jìn)程。TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在急性和慢性炎性疾病早期是一種重要的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)循環(huán)中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移并浸入支氣管肺泡腔，使其激活和脫顆粒，產(chǎn)生氧自由基，釋放顆粒酶[9]。IL-6也是由LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的炎性細(xì)胞因子。汪雪峰等[10]研究表明，莰醇可以降低血清中TNF-α、角化生長(zhǎng)因子、IL-1β和IL-6的含量，起到改善肺炎的作用。Espírito-Santo等[11]研究表明，在小鼠足炎模型中，布拉易林可以抑制促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，達(dá)到抑制炎癥的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組(LPS組)促炎因子IL-6和TNF-α水平明顯高于空白組，說(shuō)明LPS引起了小鼠肺部的炎癥反應(yīng)。與LPS組相比，苦參堿組、黃芩苷組、聯(lián)合高、中、低劑量組明顯降低IL-6、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明各用藥組均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗炎作用。且各用藥組間及用藥組與空白組間在IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量上差異無(wú)顯著性，說(shuō)明各用藥組間對(duì)肺炎的抑制作用無(wú)差異，與空白組無(wú)差異，提示抑制炎癥的效果很好。且在用藥組中，聯(lián)合低劑量組是用藥量最少的，所以從量效關(guān)系上看，聯(lián)合低劑量組的效果最好。

MPO在中性粒細(xì)胞中表達(dá)最豐富，MPO活性與肺組織中的中性粒細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)[12]。中性粒細(xì)胞有趨化、變形和黏附、吞噬及殺菌作用，在機(jī)體防御和抵抗病原菌侵襲過(guò)程中起著重要作用[13]。所以，可以通過(guò)肺組織中MPO活性的高低來(lái)判斷炎癥程度。在Yin等[14]的研究中，異氟醚可以通過(guò)降低MPO的活性，保護(hù)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺損傷。本實(shí)驗(yàn)中，LPS組小鼠肺組織的MPO活性明顯高于空白組，說(shuō)明LPS促進(jìn)了中性粒細(xì)胞的活化和產(chǎn)生，從而導(dǎo)致MPO活性升高；而苦參堿組、黃芩苷組、聯(lián)合高、中、低劑量組中肺組織的MPO活性與LPS組比較均明顯減少，且各用藥組間、用藥組與空白組間差異均無(wú)顯著性，說(shuō)明用藥組可能是抑制了中性粒細(xì)胞的活化和產(chǎn)生，從而導(dǎo)致MPO活性降低。本研究結(jié)果表明，苦參堿、黃芩苷單獨(dú)作用和二者聯(lián)合作用都有很好的抗炎效果，且它們之間的抑炎效果差異無(wú)顯著性，其中聯(lián)合低劑量組用藥量最少。所以，后續(xù)我們將在7.5 mg·kg-1苦參堿和50 mg·kg-1黃芩苷聯(lián)合使用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其最佳配伍劑量和機(jī)制。

綜上，綜合考慮用藥量和藥效，聯(lián)合低劑量組用量最少，效果與單獨(dú)用藥組差異無(wú)顯著性，相比較而言更加經(jīng)濟(jì)，且用量減少也會(huì)降低藥物的毒性，所以，臨床上推薦使用苦參堿和黃芩苷聯(lián)合使用。研究表明，炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生與NF-κB通路有關(guān)[15]，后續(xù)將從這條通路對(duì)苦參堿聯(lián)合黃芩苷抗炎機(jī)制進(jìn)行深入研究。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)是在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝!)