一測多評法測定山楂葉提取物中4種成分的含量*

徐寶欣，杜義龍，潘海峰，趙勝男

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實驗室， 河北承德 067000）

山楂葉提取物是薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂 Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物，其成方制劑為益心酮片。本課題組多年來采用高效液相色譜法等不同的分析手段，通過測定不同采收期、不同產(chǎn)地的山楂葉及制劑中多種成分和總黃酮成分含量，在建立指紋圖譜的基礎(chǔ)上評價了山楂葉及其制劑的質(zhì)量[1-6]。本課題組在研究過程中一直利用外標(biāo)曲線法（ESM）測定其中目標(biāo)成分的含量，但外標(biāo)法所用的對照品價格昂貴，甚至有些對照品性質(zhì)不穩(wěn)定，因此增加了含量測定的成本和難度，限制了多成分質(zhì)量控制模式在企業(yè)生產(chǎn)、科研和監(jiān)督中的應(yīng)用。一測多評法（QAMS）可在缺少對照品或?qū)φ掌凡环€(wěn)定的情況下對中藥及其制劑進(jìn)行快速、低廉的質(zhì)量控制。為此，本研究采用一測多評法測定山楂葉提取物中4種成分的含量，以期建立適用性更強(qiáng)的含量測定方法，完善山楂葉提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1200 Series高效液相色譜儀（美國Agilentg公司），配套Chemstation色譜工作站；AG-245型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒）。

10批山楂葉提取物（山東臨沂愛康藥業(yè)有限公司，批號：AKH15-1～AKH15-10）；牡荊素鼠李糖苷（批號：16060103）、牡荊素葡萄糖苷（批號：16072806）、金絲桃苷（批號：16081504）、牡荊素（批號：16070601），均購買于成都普飛德生物技術(shù)有限公司。四氫呋喃、甲醇、乙腈為色譜純（購買于美國Fisher公司）；純凈水（購買于娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250×4.6 mm，5μm）；流動相為0.6%乙酸水-乙腈-四氫呋喃系統(tǒng)，梯度洗脫：0～10min，7～15%乙腈，10～25min，15%乙腈，四氫呋喃25min內(nèi)所占比例一直為2%；檢測波長350nm；體積流量1ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量0.01μl。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱量牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷、金絲桃苷、牡荊素對照品適量，用流動相溶解，制成每1ml含牡荊素鼠李糖苷1.046mg、牡荊素葡萄糖苷0.756mg、金絲桃苷0.219mg、牡荊素0.211mg的混合溶液，作為儲備液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品0.025g，置具磨口塞10ml量瓶中，加60%無水乙醇溶解并稀釋到刻度，進(jìn)樣前以微孔濾膜(0.45μm有機(jī)膜)濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 線性關(guān)系考察 量取2.2中混合對照品儲備液適量，按倍數(shù)稀釋法制成一系列對照品溶液。按2.1的色譜條件進(jìn)行測定，記錄4種成分的峰面積。以待測成分進(jìn)樣量質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得到4種成分的回歸方程和線性范圍。見表1：

表1 4種成分的回歸方程與線性范圍

2.5 精密度試驗 取倍數(shù)稀釋后的混合對照品溶液（2.2），按同一色譜條件（2.1）連續(xù)進(jìn)樣測定6次，分別記錄4個成分的峰面積。結(jié)果牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷、金絲桃苷、牡荊素峰面積的RSD值分別為1.33%、0.94%、0.80%、0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取2.3中的供試品溶液，測定樣品室溫下放置0、2、4、8、12、24h的峰面積，4種成分24h內(nèi)峰面積的RSD值分別為1.02%、1.52%、1.31%、0.84%（n=6），表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品適量，按2.3的方法制備6份溶液，按2.1的色譜條件進(jìn)行測定，4個成分峰面積的RSD值分別為0.62%、0.84%、1.58%、1.08%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取同一批樣品適量，分別加入一定量的4種成分對照品，按2.3的方法制備6份溶液，以2.1的色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率及RSD值。結(jié)果4種成分的回收率依次為100.82%、99.62%、102.88%、99.40%，RSD值分別為0.54%、1.22%、1.47%、2.16%，結(jié)果符合2015版《中國藥典》的要求［7］。

2.9 相對校正因子（RCF）的計算 本研究以牡荊素葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)物，按一測多評法公式［8］計算，結(jié)合系列混合對照品溶液所測得的峰面積，計算牡荊素葡萄糖苷對另外3種成分的RCF值。結(jié)果，牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、牡荊素的RCF值分別為0.963、1.116、1.034。

2.10 RCF耐用性的考察 本研究考察了不同儀器（Agilent1200、Agilent1220、Agilent1260）和不同色譜柱[色譜柱型號均為(5μm，250×4.6mm)]對RCF的影響，結(jié)果見表2：RCF在本研究考察的儀器與色譜柱中耐用性較好（RSD＜3%）。

表2 不同儀器和色譜柱測得的RCF

2.11 樣品含量的測定 分別取10批山楂葉提取物適量，按照2.3的方法制備供試品溶液，按照2.1的色譜條件進(jìn)樣測定，對比了經(jīng)典外標(biāo)曲線法與一測多評法測得的4種成分的含量，見表3：一測多評法（QAMS）與外標(biāo)曲線法（ESM）測定結(jié)果比較，牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、牡荊素的含量無明顯差異。

表3 樣品中4種成分的含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

山楂葉提取物目前收載于2015版藥典，僅以金絲桃苷單一成分作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，存在一定的局限性。本研究對山楂葉提取物中4種成分建立了一測多評法，在方法建立的過程中發(fā)現(xiàn)，影響此方法的因素有很多，包括儀器、色譜柱、實驗環(huán)境等。本研究為保證方法的適用性和重現(xiàn)性，對不同型號、不同產(chǎn)家儀器和不同品牌的色譜柱進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示山楂葉提取物中選用牡荊素葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)物時，牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷和牡荊素的相對校正因子具有很好的重現(xiàn)性。另外，內(nèi)參物的選擇、待測成分濃度、色譜條件等也是一測多評法是否成功建立的主要內(nèi)部因素。

本研究以牡荊素葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)物，外標(biāo)曲線法與一測多評法測定牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、牡荊素3種成分的含量無明顯差異，且易得、穩(wěn)定、檢測成本低，綜合考慮故選擇牡荊素葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)物。

因此，本研究建立的一測多評法穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度好，可用于山楂葉提取物中牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷、金絲桃苷和牡荊素含量的同時測定。