烏司他丁在脂多糖/尼日利亞菌素誘導的巨噬細胞焦亡中的作用

周俊杰，吳實正，段鵬凱，袁媛，何璇，童華生

膿毒癥是由感染導致的臟器功能不全，在ICU中具有較高病死率[1]，其病理機制不僅限于病原微生物對機體細胞的損傷，同時也是機體的一種“失控的自主反應”[2-3]。巨噬細胞是機體重要的天然免疫細胞，在病原菌的吞噬和消化過程中具有重要作用。目前一些研究認為，巨噬細胞釋放的大量炎癥介質是膿毒癥狀態(tài)下造成臟器損傷的重要原因[4]。2001年被首次提出的細胞焦亡[5](pyroptosis)是一種半胱天冬酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1)依賴性細胞死亡方式[6]，是主要發(fā)生于巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫細胞的炎癥性細胞死亡，伴隨有大量炎癥介質的釋放。這種大量炎癥介質釋放的表現提示其可能與膿毒癥過程中的過度炎癥反應相關。烏司他丁(ulinastatin，UTI)是一種蛋白酶抑制劑[7]，動物實驗及臨床研究均提示其可降低膿毒癥動物/患者循環(huán)血液中炎癥介質的水平，具有良好的抗炎作用[8-10]，但具體機制尚不完全明確。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/尼日利亞菌素(nigericin)聯(lián)合刺激骨髓源性巨噬細胞構建體外巨噬細胞焦亡模型，探討烏司他丁對巨噬細胞焦亡的作用及其可能的抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)購自美國MP公司，白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α檢測試劑盒及乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司，IL-18檢測試劑盒購自美國賽默飛世爾科技有限公司?？拱腚滋於?1(caspase-1)及Gasdermin D蛋白(GSDMD)一抗購自英國Abcam公司，二抗購自上海Absin公司。UTI購自廣東天普公司，RT-qPCR引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。

1.2 骨髓源性巨噬細胞分離及培養(yǎng) C57BL/6小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，8～10周齡，體重20～25g。頸椎脫臼法處死小鼠，沿股骨上段和脛骨下端關節(jié)處將股骨和脛骨剪斷取出；在距離骨髓腔末2mm處切除股骨和脛骨的兩端，使骨髓腔充分暴露；將1ml注射器針頭插入暴露的骨髓腔內，完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至白色狀態(tài)，收集骨髓沖洗液，離心去上清，用含有10ng/ml小鼠巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，MCSF)的完全培養(yǎng)基重懸細胞，鋪于6孔板，置于37℃含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，每次換液時MCSF濃度加倍。小鼠巨噬細胞在第6天分化完畢，第7天進行實驗。

1.3 細胞焦亡模型的建立及UTI預處理 按照文獻[11]方法采用LPS/尼日利亞菌素誘導巨噬細胞構建巨噬細胞焦亡模型。將細胞分為對照組、UTI組、模型組和模型+UTI組，其中，UTI組和模型+UTI組在建模前給予1000U/ml UTI預處理，其余兩組給予等量PBS。模型組和模型+UTI組先用LPS 100ng/ml刺激培養(yǎng)的巨噬細胞4h，再加入10μmol/L尼日利亞菌素繼續(xù)刺激2h，進行相關檢測；對照組及UTI組在此期間僅給予等體積PBS，在相同時間點進行檢測。

1.4 MTT法檢測細胞活力 將細胞接種于96孔板中，按上述方法刺激后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入0.5mg/ml的MTT溶液150μl，37℃避光孵育4h，去上清，每孔加入DMSO溶液150μl，結晶物充分溶解后應用酶標儀于490nm處測量各孔吸光度(OD)值。細胞存活率=各組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 分光光度法檢測細胞LDH釋放率 收集各組細胞上清，按照試劑盒說明書檢測釋放出的LDH，裂解剩余的貼壁細胞檢測LDH，兩者之和即為總LDH。LDH釋放率=上清LDH含量/總LDH含量×100%。

1.6 Western blotting檢測caspase-1和GSDMD蛋白表達 提取各組細胞蛋白，按常規(guī)步驟進行Western blotting分析，檢測細胞caspase-1、GSDMD表達及活化情況，結果圖采用Image J進行灰度分析。

1.7 細胞上清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6蛋白水平檢測 收集細胞上清，采用ELISA測定各因子水平，顯色反應終止后，使用酶標儀在450nm處檢測各孔OD值，根據繪制的標準曲線，計算各孔IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6濃度。

1.8 細胞IL-1β、IL-18 mRNA水平檢測 采用RT-qPCR檢測各組細胞IL-1β、IL-18 mRNA水平，各目的基因引物序列見表1。按照文獻[12]方法通過2–ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，在滿足方差齊性的條件下，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-qPCR分析所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers (RT-qPCR analysis)

2 結 果

2.1 UTI預處理對LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細胞存活率及LDH釋放率的影響 MTT結果顯示，與對照組比較，經LPS/尼日利亞菌素作用后，模型組巨噬細胞存活率下降至73.40%，給予UTI預處理后，存活率上升(73.40%vs.86.30%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1A)。經LPS/尼日利亞菌素聯(lián)合刺激后，LDH釋放明顯增加。給予UTI預處理后，LDH釋放率明顯下降(22.45%vs.14.80%，P＜0.05，圖1B)。

2.2 UTI預處理對LPS/尼日利亞菌素作用后巨噬細胞caspase-1活化、GSDMD片段化的影響 Western blotting結果顯示，LPS/尼日利亞菌素作用下，巨噬細胞caspase-1(圖2A)和GSDMD(圖2B)的活性形式即片段化條帶明顯增強，UTI的干預有效減弱了該作用?；叶确治霰砻?，UTI預處理降低了LPS/尼日利亞菌素刺激所致的caspase-1活化，且GSDMD片段化水平增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 UTI預處理對LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細胞IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白表達的影響RT-qPCR結果顯示，LPS/尼日利亞菌素聯(lián)合刺激后，細胞中IL-1β及IL-18 mRNA水平上升，兩者在細胞上清中的釋放明顯增加。UTI預處理明顯降低了LPS/尼日利亞菌素作用下細胞上清中IL-1β(403.50±92.63pg/mlvs.253.50±62.93pg/ml，P=0.015)和IL-18的釋放水平(325.32±23.33pg/mlvs.216.02±38.18pg/ml，P=0.009，圖3)。

圖1 UTI對LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細胞存活率(A)及LDH釋放率(B)的影響(n=3)Fig.1 Effects of ulinastatin on cell viability (A) and LDH release rate (B) of LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

圖2 UTI對LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細胞caspase-1活化(A)與GSDMD片段化(B)的影響(n=3)Fig.2 Influence of ulinastatin on caspase-1 activity (A) and GSDMD gragmentation (B) in LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

2.4 UTI預處理對LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細胞上清TNF-α和IL-6水平的影響 在LPS/尼日利亞菌素作用下，巨噬細胞釋放的重要炎癥介質TNF-α和IL-6的水平明顯升高(P＜0.05)。在相同LPS/尼日利亞菌素條件刺激下，經UTI預處理后，細胞上清TNF-α(311.30±33.02pg/mlvs.206.10±28.84pg/ml，P＜0.05)和IL-6(212.60±32.72pg/mlvs.143.77±6.36pg/ml，P＜0.05，圖4)水平明顯下降。

圖3 UTI對LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細胞IL-1β、IL-18 mRNA表達及蛋白釋放的影響(n=3)Fig.3 Effects of ulinastatin on mRNA expression and protein release of IL-1β and IL-18 in LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

圖4 UTI對LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細胞TNF-α(A)和IL-6(B)釋放的影響(n=3)Fig.4 Effects of ulinastatin on TNF-α (A) and IL-6 (B) release from LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

3 討 論

膿毒癥的病理生理機制之一是過度的炎癥反應，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中，循環(huán)系統(tǒng)中的炎癥瀑布是導致多臟器功能衰竭的重要因素。近年來越來越多的研究發(fā)現，在感染狀態(tài)下發(fā)生的細胞焦亡與機體的炎癥反應密切相關。在LPS/尼日利亞菌素誘導的細胞焦亡中，LPS可與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)結合，促進炎癥介質轉錄增加；尼日利亞菌素則可通過活化炎性小體，募集caspase-1并使其發(fā)生自身剪切，進而活化，活化的caspase-1可剪切IL-1β和IL-18的前體，使其成為活化形式[13]。同時，炎性小體的組成成分GSDMD發(fā)生剪切，參與形成細胞膜小孔，一方面，炎性介質IL-1β、IL-18可通過小孔釋放至細胞外[14]；另一方面，小孔的形成導致細胞內外滲透壓改變，進而腫脹，最終導致細胞破裂。可見，細胞焦亡在感染狀態(tài)下可通過誘導被感染細胞死亡，清除細胞內的病原菌，限制其生長。然而，大量的細胞焦亡可導致過度的炎癥反應，IL-1β、IL-18的釋放又可激活其他免疫細胞向感染部位聚集，大量炎性細胞浸潤，再次加劇炎癥因子釋放，導致發(fā)熱、低血壓等表現[15-16]。

巨噬細胞焦亡在感染狀態(tài)下放大炎癥反應的特征提示其可能是導致膿毒癥過度炎癥反應的原因。因此，本研究通過分離小鼠骨髓細胞，并誘導分化為巨噬細胞，以LPS/尼日利亞菌素聯(lián)合刺激構建體外巨噬細胞焦亡模型，探討UTI在巨噬細胞焦亡中的作用。結果顯示，應用UTI預處理后，巨噬細胞片段化caspase-1和GSDMD水平均明顯下降，同時IL-1β、IL-18 mRNA水平及上清中的分泌量均明顯降低，提示UTI可抑制巨噬細胞焦亡。

UTI最初是從尿液中分離出的一種尿胰蛋白酶抑制劑，可抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶等多種蛋白酶的活性[17]。UTI結構中的糖肽結構域具有穩(wěn)定細胞膜的作用，是發(fā)揮蛋白酶釋放抑制作用的主要區(qū)域[18]。本研究顯示，UTI一方面可抑制焦亡關鍵蛋白caspase-1及GSDMD的片段化，阻抑焦亡信號通路的傳導；另一方面，細胞焦亡最終是由于細胞膜上形成GSDMD小孔，導致細胞破裂而死亡，UTI具有穩(wěn)定細胞膜作用的糖肽結構域可能是其減緩巨噬細胞焦亡的另一機制。

細胞焦亡是一種極為劇烈的細胞炎癥反應，也是一種細胞死亡方式。本研究顯示，UTI除可抑制巨噬細胞死亡外，還可抑制LPS/尼日利亞菌素刺激后巨噬細胞炎癥介質的轉錄和釋放水平。一方面，UTI可抑制LPS刺激后的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族磷酸化及NF-κB活化[19–21]，降低炎癥介質的轉錄水平；另一方面，目前認為IL-1β/IL-18激活和分泌主要依賴于caspase-1，而UTI抑制caspase-1活化，可抑制IL-1β及IL-18的剪切成熟。同時，UTI可穩(wěn)定細胞膜，抑制GSDMD小孔形成，降低促炎癥因子的釋放。盡管IL-1β及IL-18不是細胞死亡程序中所必須的，但它們的產生有助于焦亡細胞炎癥反應的發(fā)生，同時與機體強烈炎癥反應導致的發(fā)熱、低血壓相關[22]。本研究初步揭示了UTI降低炎癥反應的作用機制，為其在膿毒癥治療中的應用提供了依據。