腐敗希瓦氏菌及其與蜂房哈夫尼亞菌共培養(yǎng)對(duì)冷藏大菱鲆的致腐能力

李婷婷，馬 艷，李學(xué)鵬，儀淑敏，勵(lì)建榮,

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）屬于鰈形目、鲆科、菱鲆屬，俗稱歐洲比目魚，在中國俗稱“多寶魚”，原產(chǎn)于歐洲大西洋海域，是世界公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)比目魚之一[1]。大菱鲆的肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美，營養(yǎng)價(jià)值豐富，且其生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)。自從1992年被成功引入我國后，使我國鲆鰈類養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，成為了我國海水養(yǎng)殖魚類的支柱產(chǎn)業(yè)。目前，大菱鲆的養(yǎng)殖主要集中在山東、遼寧等北方地區(qū)，且其銷售半徑逐步擴(kuò)大。但是由于大菱鲆水分和營養(yǎng)物質(zhì)含量高，易腐敗變質(zhì)，因此大菱鲆在貯運(yùn)過程中的品質(zhì)特性和質(zhì)量安全日益引起人們的關(guān)注[2]。

鮮度是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，水產(chǎn)品的價(jià)值大多取決于其鮮度[3]。水產(chǎn)品在貯藏過程中極易在微生物、酶及脂肪氧化等作用下發(fā)生腐敗變質(zhì)，其鮮度變化與微生物生長、理化指標(biāo)變化及蛋白質(zhì)降解都有著密切關(guān)系[4]。盡管引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的因素較多，但其最主要的原因是微生物的生長代謝[5]。在水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)過程中，不同微生物的致腐能力存在差異，其中只有部分微生物參與了腐敗過程，這些微生物被稱作特定腐敗菌（specific spoilage organisms，SSO）[6-7]。SSO在水產(chǎn)品貯藏過程中的生長速度較其他微生物快，且其致腐能力強(qiáng)[8]。有研究表明，在有氧冷藏過程中，來源于不同水域水產(chǎn)品的SSO多為假單胞菌（Pseudomonas spp.）或者腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），而來自受污染水域水產(chǎn)品的SSO是腸細(xì)菌（Enterobactericeae）[9-10]。崔正翠等[11]發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是冷藏大菱鲆的SSO。Nychas等[12]研究發(fā)現(xiàn)一些耐冷的腸桿菌，如蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）、成團(tuán)腸桿菌（Enterobacter agglomerans）、變形斑沙雷菌（Serratia proteamaculans）等，在肉及肉制品中數(shù)量不多，卻能夠引起其腐敗變質(zhì)。因此，研究水產(chǎn)品腐敗菌在水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)中所起作用具有重要意義。

腐敗希瓦氏菌是一種嗜冷革蘭氏陰性菌，為運(yùn)動(dòng)桿菌，致腐潛力大，能夠?qū)⒀趸装愤€原為三甲胺，并產(chǎn)生硫化氫，同時(shí)能夠降解一些含硫氨基酸產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物，該菌在低溫貯藏魚類及其他產(chǎn)品腐敗過程中起到重要作用[13]。蜂房哈夫尼亞菌是革蘭氏陰性、運(yùn)動(dòng)性、有鞭毛的兼性厭氧桿菌，是細(xì)菌性食品污染菌，能夠造成富含蛋白質(zhì)的乳制品、肉制品及水產(chǎn)品在低溫貯藏條件下的腐敗變質(zhì)，同時(shí)也是一種條件性致病菌[14]。本實(shí)驗(yàn)將從腐敗大菱鲆中分離得到的腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01的混合菌接種于大菱鲆無菌魚塊中，通過研究其在冷藏期間新鮮度相關(guān)指標(biāo)（菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基總氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、K值、Ca2＋-ATPase活力及肌肉蛋白結(jié)構(gòu)）的變化，來探究腐敗希瓦氏菌SP22對(duì)大菱鲆的致腐潛力，也為探討水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌及共生菌的致腐機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖大菱鲆購買于遼寧省錦州市水產(chǎn)市場(chǎng)，每條魚的質(zhì)量為（850±50）g。

蜂房哈夫尼亞菌Ha-01、腐敗希瓦氏菌SP22均從腐敗大菱鲆中分離獲得，并由遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株在溶菌（lysogeny broth，LB）肉湯培養(yǎng)基中28 ℃、160 r/min搖床過夜培養(yǎng)，備用。

平板計(jì)數(shù)瓊脂、LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司；超微量Ca2＋-ATPase試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；HZQ-X300C型恒溫振蕩器、BPS-100CA恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī)美國Thermo Fisher Scientific公司；BCM-1000A型生物潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化過濾設(shè)備有限公司；Bag Mixer 400型拍打均質(zhì)機(jī) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；UV2550紫外-可見分光光度計(jì)杭州惠爾儀器設(shè)備有限公司；NMI20型核磁共振成像儀上海紐邁電子科技有限公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 大菱鲆無菌魚塊的制備

參照Herbert[15]和李學(xué)英[16]等的方法制備大菱鲆無菌魚塊。將大菱鲆清洗后，無菌操作切取大菱鲆背部魚肉，去皮，用滅菌剪刀修剪魚塊至大小形狀一致（25～35 g/塊）后，無菌水清洗，然后用無菌濾紙擦拭魚塊表面水分，再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭魚塊，最后將制備好的魚塊放在酒精燈火焰周圍灼燒1～2 s。上述所有步驟均在無菌操作臺(tái)中完成。對(duì)制備好的大菱鲆無菌魚塊進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，菌落總數(shù)小于102CFU/g即符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.3.2 腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌菌懸液制備及接種

分別挑取腐敗希瓦氏菌SP22及蜂房哈夫尼亞菌Ha-01，在LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，28 ℃過夜培養(yǎng)。再分別挑取二者的單菌落于滅菌LB肉湯培養(yǎng)基中28 ℃搖床過夜培養(yǎng)，取1 mL培養(yǎng)后的菌液10 000 r/min、1 min離心，棄去上清液，加生理鹽水溶解沉淀，利用比濁儀與麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)定并換算，將其數(shù)量調(diào)節(jié)至約108CFU/mL。再用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL。二者的混合菌液由制備好的兩種菌液按體積比1∶1混合制得。然后將大菱鲆無菌魚塊浸入制備好的菌懸液中，約3～5 s后撈出瀝干。使用滅菌生理鹽水浸泡作為對(duì)照。將接種后的魚塊裝入無菌蒸煮袋中，密封包裝，置于4 ℃冰箱冷藏，連續(xù)7 d每天取樣測(cè)定其新鮮度指標(biāo)變化。

1.3.3 冷藏大菱鲆魚塊的新鮮度指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 菌落總數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[17]采用平板傾注法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.2 TVB-N值的測(cè)定

TVB-N值參考FOSS應(yīng)用子報(bào)《鮮魚和凍魚中揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）的測(cè)定》[18]使用全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.3 K值的測(cè)定

K值參考Li Tingting等[19]的方法稍作修改進(jìn)行測(cè)定。稱取5 g絞碎的魚肉于燒杯中，加入25 mL 0.6 mol/L的高氯酸，充分勻漿后，3 000×g離心10 min，取上清液，用1 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)至6.5～6.8，靜置30 min后，3 000×g離心10 min，取上清液，置于－80 ℃貯藏備用。使用前用0.45 μm的水相濾膜過濾。K值按公式（1）計(jì)算。

式中：c（HXR）、c（HX）、c（ATP）、c（ADP）、c（AMP）、c（IMP）分別為次黃嘌呤核苷（inosine）、次黃嘌呤（hypoxanthine）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate）、腺苷酸（adenine nucleotides）、肌苷酸（inosine monphosphate）含量/（μmol/g）。

1.3.3.4 Ca2＋-ATPase活力的測(cè)定

Ca2＋-ATPase活力參照超微量Ca2＋-ATPase試劑盒的操作說明進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.5 掃描電子顯微鏡觀察肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)

取絞碎后的大菱鲆魚肉，加入5 倍體積的20 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.2），均質(zhì)后5 000 r/min、10 min離心。取沉淀，加入5 倍體積的10 mmol/L Tris-HCl-NaCl溶液（pH 7.2），均質(zhì)后5 000 r/min、10 min離心。取上清液，采用雙縮脲法測(cè)定蛋白液濃度。

參考劉焱[20]的方法稍作修改。首先將提取的魚肉蛋白質(zhì)冷凍干燥后，放入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中浸泡24 h。使用pH 7.0磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，10 min/次。取出后先分別放入體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中浸泡2 次，10 min/次，再經(jīng)醋酸異戊酯置換2 次，15 min/次，取出后放入冷凍干燥儀中干燥后磨成粉末。將樣品噴金后使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS 19.0及Origin 8.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，應(yīng)用One-way ANOVA模型進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的變化

圖1 大菱鲆4 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig. 1 Total viable count changes of turbot during storage at 4 ℃

魚類所含營養(yǎng)物質(zhì)豐富，具有高蛋白含量和高水分含量等特點(diǎn)，其中微生物的生長繁殖是導(dǎo)致魚體死后腐敗變質(zhì)的主要誘因[21]。由圖1可知，在冷藏過程中3 組樣品的菌落總數(shù)均隨貯藏時(shí)間的延長而增加：其中接種腐敗希瓦氏菌SP22的實(shí)驗(yàn)組在貯藏第7天時(shí)達(dá)到7.57（lg（CFU/g））；接種腐敗希瓦氏菌SP22與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01的混合菌組樣品菌落總數(shù)在第6天時(shí)已經(jīng)達(dá)到7.37（lg（CFU/g）），在貯藏第7天時(shí)達(dá)到8.30（lg（CFU/g））；而空白對(duì)照組在貯藏第7天時(shí)才達(dá)到4.95（lg（CFU/g））。根據(jù)國際微生物規(guī)格委員會(huì)食品微生物限量規(guī)定，魚類菌落總數(shù)的可接受水平限量為5.70（lg（CFU/g）），最高安全限量為7.00（lg（CFU/g））[22]。所以接種菌株腐敗希瓦氏菌SP22的樣品組在貯藏第7天時(shí)超過最高安全限量，達(dá)到腐敗，接種腐敗希瓦氏菌SP22和蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的魚塊在第6天時(shí)已經(jīng)達(dá)到腐敗終點(diǎn)，而空白對(duì)照組在貯藏第7天時(shí)還未超過可接受限量。說明腐敗希瓦氏菌SP22能夠加快大菱鲆無菌魚塊的腐敗變質(zhì)，且當(dāng)其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01共培養(yǎng)時(shí)致腐潛力更大。張旭東等[23]的研究也表明，蜂房哈夫尼亞菌能夠加快冷藏牛肉的腐敗，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

2.2 TVB-N值的變化

圖2 大菱鲆4 ℃貯藏過程中TVB-N值的變化Fig. 2 Change in TVB-N value of turbot fillets during storage at 4 ℃

在水產(chǎn)品貯藏中，TVB-N是蛋白質(zhì)在細(xì)菌和酶的共同作用下分解產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，能夠有效表征水產(chǎn)品的品質(zhì)變化[24]。由圖2可知，接種腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的魚塊在冷藏期間TVB-N值增長速度明顯快于空白對(duì)照組（P＜0.05）。其中，接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊在第6天時(shí)TVB-N值達(dá)到35.33 mg/100 g；接種混合菌株的魚塊在第5天時(shí)TVB-N值達(dá)到36.31 mg/100 g；而空白對(duì)照組的無菌魚塊在第7天時(shí)TVB-N值才達(dá)到26.31 mg/100 g。根據(jù)GB/T 5009.45—2003《水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[25]中規(guī)定：海水魚TVB-N值低于13 mg/100 g時(shí)為一級(jí)鮮度；超過30 mg/100 g時(shí)即不可食用。因此接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊在第6天時(shí)已經(jīng)腐敗，而接種混合菌株的魚塊在第5天時(shí)已經(jīng)腐敗，這與菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果基本一致。

2.3 K值的變化

一般認(rèn)為，魚體死亡后，其肌肉內(nèi)的ATP會(huì)降解為ADP、AMP、IMP、HXR及HX。K值即HXR與HX占ATP及其相關(guān)物質(zhì)總量的百分比[26]，能夠較好地反映水產(chǎn)品在貯藏期間的新鮮度變化，K值越小表明其新鮮度越好。一般認(rèn)為即殺魚K值≤10%，當(dāng)K值≤20%時(shí)可作為生魚片的原料，在20%～40%范圍內(nèi)為一級(jí)鮮度，在40%～60%范圍內(nèi)為二級(jí)鮮度，在60%～80%范圍則為初期腐敗[27]。

由圖3可知，大菱鲆無菌魚塊初始K值為5.54%，品質(zhì)較高，在4 ℃條件下貯藏時(shí)，K值隨著貯藏時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且接菌組K值變化明顯快于空白對(duì)照組（P＜0.05）。其中，接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊K值在第6天時(shí)為66.73%，已經(jīng)達(dá)到初期腐敗，而接種混合菌組的魚塊在第5天時(shí)已經(jīng)達(dá)到68.85%，表明魚塊為初期腐敗。

圖3 大菱鲆4 ℃貯藏過程中K值的變化Fig. 3 Change in K value of turbot fillets during storage at 4 ℃

2.4 Ca2＋-ATPase活力的變化

肌原纖維蛋白的主要組成成分是肌球蛋白，ATPase活性源于其球狀結(jié)構(gòu)頭部，在冷藏過程中肌球蛋白發(fā)生變性時(shí)，ATPase活性也隨之變化，直至失去活性[28]。因此可以用Ca2＋-ATPase活性作為評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)品質(zhì)的指標(biāo)，繼而反映肌肉的變化情況[29]。

由圖4所示可知，各實(shí)驗(yàn)組的Ca2＋-ATPase活力在整個(gè)貯藏期間呈下降趨勢(shì)，且接菌組下降速度明顯快于空白對(duì)照組（P＜0.05）。其中接種腐敗希瓦氏菌SP22以及接種其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的魚塊在貯藏前3 d時(shí)Ca2＋-ATPase活力變化情況基本一致，而從第4天開始，接種混合菌的魚塊下降速度明顯快于接種腐敗希瓦氏菌SP22單菌組，說明腐敗希瓦氏菌可以影響大菱鲆無菌魚塊Ca2＋-ATPase活力的變化及其蛋白質(zhì)的變性，且蜂房哈夫尼亞菌的存在能夠加速腐敗。

2.5 肌原纖維蛋白顯微結(jié)構(gòu)的變化

圖4 大菱鲆4 ℃貯藏過程中Ca2＋-ATPase活力的變化Fig. 4 Change in Ca2+-ATPase activity of turbot fillets during storage at 4 ℃

從圖5可以看出，在第0天時(shí)各組的肌肉蛋白質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)完整，表面平滑，隨著貯藏時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面逐漸出現(xiàn)孔隙和碎片化。其中，空白對(duì)照組在第5天時(shí)蛋白質(zhì)表面才開始出現(xiàn)溝壑，第7天時(shí)出現(xiàn)較為明顯的斷裂。接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊從第4天開始，蛋白質(zhì)出現(xiàn)較大孔穴，此后蛋白質(zhì)繼續(xù)降解、變性。而接種腐敗希瓦氏菌SP22與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的實(shí)驗(yàn)組，在冷藏過程中蛋白質(zhì)破碎速度更快，在貯藏第1天時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)明顯扭曲，然后蛋白質(zhì)逐漸斷裂，第3天開始出現(xiàn)較大孔穴，第5天破碎現(xiàn)象已經(jīng)較為嚴(yán)重。根據(jù)王發(fā)祥等[30]研究的草魚肌肉蛋白變化結(jié)果可知，在貯藏過程中，蛋白質(zhì)能夠受到組織酶的影響而發(fā)生水解，使蛋白質(zhì)不斷地降解變性，最終出現(xiàn)小片化。由此說明，接種大菱鲆SSO能夠加快魚肉蛋白質(zhì)的降解變性速度。

圖5 大菱鲆4 ℃貯藏過程中肌肉蛋白質(zhì)的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 Scanning electron microscope images of turbot muscle proteins during storage at 4 ℃

3 結(jié) 論

通過對(duì)大菱鲆無菌魚塊菌落總數(shù)、TVB-N值、K值、Ca2＋-ATPase活力及肌肉蛋白的顯微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)進(jìn)行分析，比較了腐敗希瓦氏菌SP22以及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌對(duì)大菱鲆無菌魚塊的致腐潛力。結(jié)果表明：與空白對(duì)照組的大菱鲆無菌魚塊相比，接種腐敗希瓦氏菌SP22單菌組及混合菌組的魚塊的菌落總數(shù)、TVB-N值、K值、Ca2＋-ATPase活力及肌肉蛋白的顯微結(jié)構(gòu)變化速度均快于空白對(duì)照組，且接種混合菌組的魚塊腐敗速度更快，這說明接種腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01的混合菌均能夠引起大菱鲆的腐敗變質(zhì)，且二者混合時(shí)腐敗速度更快。因此，腐敗希瓦氏菌SP22具有較強(qiáng)的致腐潛力，且在營養(yǎng)物質(zhì)豐富的情況下其能夠與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01產(chǎn)生共生作用，從而加速大菱鲆魚肉的腐敗變質(zhì)。