HPLC法同時測定綠袍散中靛藍與靛玉紅

牛宇東，張 鑫，葛西航

(1.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054；2.陜西大德醫(yī)藥有限公司，西安 710075)

綠袍散是由青黛、黃柏、山豆根、薄荷、黃連、兒茶、人中白、硼砂和冰片[1]9味藥研成細粉制成的散劑，主治唇舌糜爛、咽喉腫痛等，具有清熱降火、消腫止痛的作用。方中青黛為君藥，具有清熱解毒、清肝瀉火的作用[2-3]，再配以黃柏、黃連可清熱燥濕、降火解毒[4-5]。由于青黛藥材加工復雜，產(chǎn)量低，易出現(xiàn)摻假造假染色等現(xiàn)象，會影響藥效，目前綠袍散僅有幾個簡單的化學反應和散劑的通則作為其質(zhì)量控制標準。筆者認為該標準具有一定的缺陷，定性鑒別不能反映藥品的真實質(zhì)量，因此對處方中君藥青黛增加含量測定項目。青黛的主要活性成分為靛藍和靛玉紅，目前對其測定主要有TLC掃描法[6-8]，紫外分光光度法[9-11]和HPLC法[12-18]等，本實驗參考上述文獻和《中國藥典》[19]，擬建立同時測定綠袍散中靛藍和靛玉紅的含量，作為成藥中青黛的質(zhì)量控制方法，可以更全面地反映綠袍散的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，四元洗脫泵，UV檢測器(美國安捷倫儀器公司)；UV-2700紫外可見分光光度計(日本島津公司)；BT124S型電子天平(德國賽多利斯集團)；KQ-70VDB雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 綠袍散(西安順康制藥有限公司，規(guī)格：瓶質(zhì)量1.5 g，批號：170704，170801，170802)；對照品：靛藍(批號110716-200610，質(zhì)量分數(shù)100%)，靛玉紅(批號110717-200204，質(zhì)量分數(shù)100%)，均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；磷酸，丙酮，氯仿和N，N-二甲基甲酰胺等均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-1 mL·L-1磷酸(73∶27)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：288 nm；進樣量：5 μL，在上述色譜條件下測定對照品、供試品溶液及陰性樣品溶液。理論塔板數(shù)以靛藍峰計算不低于14 500，分離度>1.5，色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取靛藍對照品4.91 mg，置于25 mL量瓶中，加DMF超聲溶解后稀釋至刻度；精密稱取靛玉紅2.52 mg，置于250 mL量瓶中，加DMF超聲溶解后稀釋至刻度，作為對照品儲備液。分別精密吸取上述靛藍和靛玉紅儲備液5 和0.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，作為對照品溶液(靛藍和靛玉紅質(zhì)量濃度分別為98.20和2.52 μg·mL-1)。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取綠袍散樣品(批號170704)0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用N，N-二甲基甲酰胺補足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜0.45 μm濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4陰性樣品溶液的制備 按照綠袍散處方工藝和處方量的1/10制備缺青黛藥材的陰性樣品，按照2.3項下供試品溶液的制備方法，同法制成陰性樣品溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液以及陰性樣品溶液各5 μL，按照2.1項下色譜條件進樣，見圖1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青黛藥材的陰性樣品對靛藍和靛玉紅的測定無干擾。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.靛藍；2.靛玉紅。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.indigotin；2.indirubin.

2.5線性關(guān)系的考察 分別精密吸取2.2項下制備的對照品溶液1，2，5，10，15和20 μL，注入液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進行測定，以進樣的質(zhì)量(ng)為橫坐標(x)、相對應的峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，結(jié)果靛藍質(zhì)量在98.20～196.40 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=1.960 5x+44.359 0，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4；靛玉紅質(zhì)量在2.52～50.40 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.157 5x+0.537 1，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。

2.6精密度實驗 取2.2項下制備的對照品溶液，按照2.1項下色譜條件分別進樣1，10和20 μL，各6次，進行測定，結(jié)果表明，對照品溶液中靛藍和靛玉紅峰面積的RSD值分別為0.46%和1.19%，均在2%之內(nèi)，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實驗 取2.3項下制備的供試品溶液，按照2.1項下色譜條件，分別在0，1，2，4，8，12和24 h測定，進樣量為5 μL，連續(xù)考察24 h，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果靛藍和靛玉紅峰面積的RSD值分別為1.39%和2.36%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復性實驗 取綠袍散樣品(批號170704)，按照2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，分別注入液相色譜儀進行測定，計算6份樣品中靛藍和靛玉紅的RSD值分別為0.73%和1.24%，結(jié)果表明，供試品溶液穩(wěn)定，該方法重復性良好。

2.9加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的綠袍散樣品(批號170704)6份，每份0.1 g，另精密稱取靛藍對照品16.86 mg，置于25 mL量瓶中，作為對照品溶液，分別往上述6份樣品中各精密加入上述靛藍對照品溶液3 mL，靛玉紅儲備液1 mL，按照2.3項下方法進行制備，按照2.1項下色譜條件進行測定，分別計算靛藍和靛玉紅的回收率，結(jié)果見表1。

表1加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test(n=6)

成分取樣量/g樣品中含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%靛藍0.102 32.174 42.023 24.100 5 95.294.81.40.101 62.159 62.023 24.095 8 95.70.103 92.208 42.023 24.092 0 93.10.101 82.163 82.023 24.118 2 96.60.100 82.142 62.023 24.042 4 93.90.102 62.180 82.023 24.086 7 94.2靛玉紅0.102 30.057 70.056 50.108 7 90.290.01.10.101 60.057 40.056 50.108 0 89.60.103 90.058 70.056 50.108 9 88.90.101 80.057 50.056 50.107 9 89.20.100 80.056 90.056 50.108 5 91.40.102 60.057 90.056 50.109 1 90.7

2.10樣品含量測定 分別取不同批號的綠袍散樣品，按照2.3項下方法制備供試品溶液，每批樣品平行制備2份，按照2.1項下色譜條件進行測定，采用外標一點法分別計算3批樣品中靛藍和靛玉紅的含量，結(jié)果(批號170704、170801和170802樣品中靛藍和靛玉紅的含量分別為21.255 5和0.564 5，20.907 8和0.558 8，21.073 9和0.565 0 mg·g-1。

3 結(jié)果與討論

3.1溶劑的選擇 《中國藥典》中靛藍的溶劑采用氯仿，靛玉紅則是N，N-二甲基甲酰胺，由于氯仿對靛玉紅的溶解性較差，實驗比較了氯仿、甲醇、丙酮及N，N-二甲基甲酰胺分別作為提取溶劑對綠袍散中靛藍和靛玉紅含量測定的影響。結(jié)果顯示，選用N，N-二甲基甲酰胺作為提取溶劑，綠袍散中靛藍和靛玉紅的含量最高，因此本實驗選用N，N-二甲基甲酰胺作為供試品溶液的提取溶劑。

3.2測定波長的選擇 實驗采用紫外分光光度計對靛藍、靛玉紅和供試品溶液分別在400～260 nm之間進行全波長掃描，由光譜圖可以看出靛藍的最大吸收波長為423，333和288 nm，靛玉紅的最大吸收波長為363和293 nm，供試品溶液的最大吸收波長為423，336和284 nm，實驗分別在288和293 nm處進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對靛藍的含量測定影響較大，對靛玉紅的含量影響不大，且靛藍的最大紫外吸收與供試品溶液的最大吸收接近，由于樣品中靛藍的含量高，因此根據(jù)供試品溶液和對照品溶液的光譜圖比較，并參考《中國藥典》青黛藥材項下對其含量測定的條件，確定實驗檢測波長為288 nm。

3.3耐受性考察 實驗對供試品溶液測定中的不同波長、流速、柱溫、色譜柱和流動性比例進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對靛藍和靛玉紅的保留時間和分離度均有影響，對峰面積和含量測定結(jié)果均無顯著性影響，因此需要對其波長、流速和柱溫等進行控制，同時采用安捷倫1260、島津LC-10A和賽默飛Ultimate3000不同型號的高效液相色譜儀進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者含量測定值的RSD<1%，差異無統(tǒng)計學意義，不影響測定結(jié)果。

3.4結(jié)果的判定 《中國藥典》2015年版規(guī)定青黛藥材中靛藍不得少于2.0%，靛玉紅不得少于0.13%，綠袍散處方中的青黛藥材占27.74%，按照處方比例青黛中靛藍的含量應不低于5.548 mg·g-1，靛玉紅不低于0.361 mg·g-1，實驗測定3批樣品的結(jié)果中靛藍和靛玉紅含量分別為20.907 8～21.255 5和0.558 8～0.565 0 mg·g-1，均符合藥典要求，因此本實驗建立的方法可作為該散劑中青黛的質(zhì)量控制方法，該方法操作簡單、準確度高、專屬性強，可為綠袍散的質(zhì)量標準修訂提供參考。