李亞科種質(zhì)資源的超低溫保存技術(shù)研究進展

朱東姿，王甲威，陳新，魏海蓉，劉慶忠

(山東省果樹研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)果樹科學(xué)觀測實驗站，山東泰安 271000)

李亞科，又稱梅亞科，桃亞科，屬于薔薇科。全世界李亞科包含10個屬，約有300多種，主要分布在北溫帶地區(qū)，中國有9個屬，約有170余種，其中5個屬原產(chǎn)于中國[1]，有著幾千年的栽培歷史，因此中國擁有豐富的李亞科栽培和野生植物資源[1]。許多種屬的果實色澤鮮艷，風(fēng)味甘美，營養(yǎng)豐富，如桃、杏、櫻桃等，也有許多種屬的種子是重要的干果和油料，如杏仁、扁桃仁等，還有種屬的花具有觀賞價值，如梅花、櫻花、碧桃、榆葉梅等。但由于人為干預(yù)越來越多，中國農(nóng)業(yè)植物資源遭到嚴(yán)重的破壞和侵蝕，野生資源在原生地已很難找到，加上外來物種和商業(yè)品種的大力推廣使得野生物種數(shù)驟減、地方品種大量被淘汰，生產(chǎn)上種植的許多主栽品種遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄，存在遺傳脆弱性的隱患。

超低溫保存被認為是對植物種質(zhì)資源進行長期保護的一種理想手段。超低溫保存，是指在超低溫(-196℃)條件下抑制種質(zhì)細胞內(nèi)一切新陳代謝活動，使細胞處于一種“暫?！睜顟B(tài)而不喪失活性的一種保存技術(shù)[2]。超低溫下種質(zhì)細胞內(nèi)代謝機制類似靜止的，從理論上看超低溫貯藏的時間是可以無限的，而且貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內(nèi)，是最有希望進行基因資源長期保存的方法[2]。超低溫保存在果樹等木本植物上的研究遠遠落后于水稻、馬鈴薯等作物，而且超低溫保存在李亞科植物上的研究又遠遠落后于蘋果、梨等其他果樹[3,4]。筆者總結(jié)了最新的超低溫保存技術(shù)，闡述了李亞科植物超低溫保存的研究進展，分析了超低溫保存技術(shù)存在的問題，并對應(yīng)用前景進行了展望。

1 超低溫保存方法

依據(jù)原理可將超低溫保存方法分為兩類：一類是依據(jù)冷凍脫水的原理結(jié)合程序降溫的傳統(tǒng)保存技術(shù)，另一類是依據(jù)植物細胞玻璃化原理采取快速降溫方式的新技術(shù)。超低溫保存新技術(shù)的主要步驟如圖1。

圖1 常見超低溫保存方法過程示意圖

1.1 材料選擇

超低溫保存的種質(zhì)材料中傳統(tǒng)的種子、花粉等材料已逐漸被莖尖和芽等分生組織所取代，尤其是休眠芽和莖尖能解決組織培養(yǎng)后代遺傳穩(wěn)定性問題，植物莖尖已在種質(zhì)超低溫保存中作為主要材料運用[4]。不管是什么材料，含水量越低，細胞液泡化程度越低，冷凍保存存活率越高[4]，材料對超低溫保存效果影響很大。因此，應(yīng)根據(jù)植物本身特點來選擇適宜的材料類型。

1.2 預(yù)處理

保存過程中材料的生理狀態(tài)對于超低溫保存的成功起著關(guān)鍵作用，因此在超低溫保存過程中必須保證材料具有最大的脫水耐受性和強勁的復(fù)蘇能力[2]。一般預(yù)處理包括兩種方法，一是整體植株的低溫馴化，如休眠芽要經(jīng)過冬天的寒冷鍛煉，離體莖尖要經(jīng)過低溫鍛煉等。二是對外植體進行預(yù)培養(yǎng)。

低溫馴化是保證植株具有脫水耐受性的重要步驟，能提高果樹超低溫保存的成活率，如蘋果、梨、甜櫻桃、桃[5-8]等。一般認為，低溫鍛煉可以提高細胞生物膜磷酸脂的不飽和程度，還可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生保護性物質(zhì)如脫落酸(ABA)、抗凍蛋白及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而產(chǎn)生抗凍效果[5]。

預(yù)培養(yǎng)是保證超低溫保存成活率的另一重要過程[9]。預(yù)培養(yǎng)的目的是進一步降低材料含水量、增加材料含糖量、提高胞液的滲透勢，減少液氮凍存過程中細胞內(nèi)水分子結(jié)冰對細胞膜的傷害，不過預(yù)培養(yǎng)液濃度過高同樣會對細胞造成傷害而降低存活率[9,10]。預(yù)處理可以是上述兩種方法的結(jié)合或選擇其一，具體操作根據(jù)材料的特性而定。譬如，利用玻璃化法保存甜櫻桃品種時可以延長預(yù)培養(yǎng)時間來代替低溫馴化[10]。

1.3 脫水或玻璃化

脫水或玻璃化是減少細胞內(nèi)自由水含量，避免在冷凍過程中冰晶對細胞的損傷[2]。在冰凍前，使用高濃度的復(fù)合冰凍保護劑(玻璃化溶液，PVS)，在25℃或0℃處理一段時間，誘導(dǎo)脫水，然后直接浸入液氮中，此時冰凍保護劑溶液和保存材料一同進入玻璃化狀態(tài)。用玻璃化溶液進行脫水處理是玻璃化冷凍成功的關(guān)鍵，要小心控制脫水程序，以防止化學(xué)毒性和過度滲透造成的傷害。甘油、乙二醇、二甲亞礬是小分子物質(zhì)，在細胞內(nèi)結(jié)合水分子，減少細胞內(nèi)自由水，但這些分子對細胞有化學(xué)毒性。蔗糖、甘露糖屬非滲透型抗凍劑，不能進入細胞，它使溶液呈膠狀而不結(jié)冰，從而避免細胞外冰晶對細胞的傷害[11]。因此優(yōu)化PVS、處理時間和處理溫度是玻璃化的重要步驟。趙艷華發(fā)現(xiàn)馬哈利櫻桃使用PVS3成活率最高[6]。筆者研究也發(fā)現(xiàn)甜櫻桃砧木吉塞拉5和吉塞拉6用PVS3成活率最高[7]，但歐李莖尖使用PVS2處理后植株再生率最高[30]。

脫水法中最常用的是包埋-干燥和包埋-玻璃化法[12,13]，即采用藻酸鈉包埋技術(shù)將材料在包埋丸中脫水或玻璃化，再用液氮保存。離體莖尖包埋法操作程序：剝?nèi)〗?jīng)低溫鍛煉的離體莖尖，預(yù)培養(yǎng)后包埋到含3%藻酸鈉中，在無菌空氣中干燥或玻璃化處理，隨后投入液氮保存。其中包埋干燥法避免了玻璃化溶液對材料的毒害作用，因而保存中莖尖的損傷更小，也更容易恢復(fù)。

1.4 冷凍

傳統(tǒng)技術(shù)常是兩步降溫法，先降到一定溫度穩(wěn)定后，再投入液氮。新方法一般是玻璃化后或干燥后直接投入液氮。一般貯存過程不會發(fā)生傷害。只要保證補充液氮，就可以長期保存材料。

1.5 解凍

解凍的速度是超低溫保存的關(guān)鍵，保存后的材料在升溫時，細胞內(nèi)會再次結(jié)冰，因此解凍時應(yīng)迅速通過冰晶生長區(qū)，避免細胞再次結(jié)冰[2]。若解凍溫度及時間掌握不好，會不同程度地引起細胞內(nèi)結(jié)冰而造成傷害。果樹離體材料超低溫保存后一般采用37～40℃水浴快速解凍。但是杏種子以緩慢降溫的方法保存到液氮中，經(jīng)緩慢解凍后成活率可達到91.5%[14]。因此，需要根據(jù)不同植物材料類型及超低溫保存前的處理確定其解凍方式。

1.6 培養(yǎng)

經(jīng)超低溫保存的材料不可避免地會受到一定程度的傷害，如對光敏感，為了減少恢復(fù)培養(yǎng)過程中的光抑制，超低溫保存后的材料通常先在黑暗或弱光下培養(yǎng)1～2周，然后再轉(zhuǎn)入正常強度光照條件下培養(yǎng)。

2 李亞科植物的超低溫保存

與其他作物一樣，李亞科植物早期的超低溫保存研究采用傳統(tǒng)方法進行。自20世紀(jì)80年代末90年代初發(fā)明了新的超低溫保存技術(shù)，現(xiàn)在各種超低溫保存方法在李亞科植物資源保存中都得到應(yīng)用(表 1)。

種子。果樹一般都是高度的雜合體，產(chǎn)生的種子也是高度多樣化的，收集野外果樹資源的種子是收集、保存野生果樹資源多樣性的好方法。前人研究發(fā)現(xiàn)含水量是超低溫保存種子最重要的因素。含水量為6.9%帶有內(nèi)果皮的杏種子，以緩凍緩解的方式保存，成活率可達到91.5%。去掉內(nèi)果皮的含水量為7.1%的種仁，以上述方式保存，成活率也可達到88.2%[14]。含水量為10.85%的酥李種子也可以成功進行超低溫保存[15]。稠李種子含水量在3.5%～15%都可進行超低溫保存，但17%以上就無法保存[16]。Marcin Michalak建議將甜櫻桃砧木馬扎德的種子干燥到含水量為16.8%～20.2 %，過高和過低都不利于超低溫保存[17]。

花粉?；ǚ鄣拈L期保存可有效解決雜交育種花期不遇的問題，同時也為花粉培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)支撐，是有特殊價值的資源。超低溫保存中花粉含水量是關(guān)鍵影響因素。常用的脫水方式是干燥脫水法，扁桃、桃、杏等植物花粉利用干燥脫水法比玻璃化脫水法成活率更高[18-21]。不同桃品種的花粉適宜于超低溫保存的含水量也差異很大，為5.0%～37%[18-20]。杏的花粉也有類似現(xiàn)象，不同品種杏的花粉含水量在9.7%～20.8%都可[21]。但在中國櫻桃‘紅楓湖’花粉超低溫保存過程中發(fā)現(xiàn)，干燥時的溫度對花粉保存的影響大于含水量[22]，推測可能是干燥時溫度過高導(dǎo)致花粉失活。因此，對于某些植物的花粉，干燥時應(yīng)該選擇低溫進行。此外，解凍方式對超低溫保存花粉的成活率也有影響，臘梅花粉解凍的時候用水浴快速化凍效果較好[23]。但是對于梅花粉，化凍方式?jīng)]有影響[24]。因此不同植物、不同品種的花粉進行超低溫保存都需要摸索最適宜的方法，要針對含水量、脫水方法、脫水時間以及解凍方式設(shè)計試驗。

休眠芽。目前休眠芽的超低溫保存研究主要集中在蘋果上[25]，李亞科植物僅有杏和扁桃休眠芽的超低溫保存獲得成功。王彩虹通過兩步法成功保存了杏休眠芽，成活率達100%[26]。肖巍、姜喜利用玻璃化法和小滴玻璃化法保存扁桃休眠芽成活率分別是61%和80%[27,28]。

離體莖尖。莖尖分化程度低，遺傳物質(zhì)穩(wěn)定，在離體條件下容易再生植株，是超低溫保存最常用的材料。國內(nèi)外已發(fā)表的李亞科超低溫保存文獻中，有49%的材料是莖尖(表1)。自1992年，Niino利用玻璃化法成功保存蘋果和李的離體莖尖[29]，各種超低溫保存技術(shù)在桃、李、杏、櫻桃等離體莖尖保存中已有大量研究[5-8,29-30]。其中杏主栽品種Nonpareil通過玻璃化法比包埋-脫水法成活率更高[31]，Shatnawi發(fā)現(xiàn)包埋-干燥法更適合甜櫻桃的一些品種[32]。櫻桃李利用包埋法成活率比小滴玻璃化法高[33]。扁桃離體莖尖通過玻璃化法、包埋-玻璃化法和包埋-干燥法都可以成活，但玻璃化法成活率最高[34]。

其它材料。除了種子、花粉、莖尖可以通過超低溫保存，杏、甜櫻桃野生種等植物的離體胚、原生質(zhì)體、懸浮細胞系等也都獲得成功[35]。其中原生質(zhì)體和懸浮細胞系作為遺傳轉(zhuǎn)化的材料，利用超低溫保存便于隨時使用，節(jié)省了每次繁瑣的制備工作，具有重要的意義。因此，選擇適宜的復(fù)合冰凍保護劑，摸索合適的處理時間對原生質(zhì)體和懸浮細胞系的超低溫保存十分重要。

3 超低溫保存在李亞科植物中的其他應(yīng)用

超低溫保存技術(shù)除了應(yīng)用于植物種質(zhì)資源的保存外，還應(yīng)用于脫毒、抗性育種和遺傳轉(zhuǎn)化，其中超低溫脫毒是目前研究的熱點。1997年，Brison用超低溫成功脫除李屬砧木莖尖中的李豆病毒，脫毒率達到50%，開創(chuàng)了超低溫療法[36]。超低溫療法，即超低溫脫毒，通過超低溫選擇性地殺死細胞，一般認為帶病毒的分化細胞含水量高，在冷凍過程中會形成冰晶而被殺死，相反，不帶病毒的分生細胞的細胞質(zhì)濃度大，冷凍后能存活，但目前對于超低溫脫除病毒的分子機理尚不明確[37]。通過超低溫療法可對感染病毒、支原體和細菌的植株進行脫毒處理。目前，已成功脫除李屬砧木、蘋果、香蕉、葡萄等植物中的各種病毒，以及甘薯的小葉支原體和柑桔的黃龍病[37,38]。

4 超低溫保存中存在的問題及前景展望

超低溫保存是目前果樹類植物遺傳多樣性長期保存的理想方法。不少種類的種質(zhì)細胞都可在超低溫條件下保存，隨著超低溫保存技術(shù)的發(fā)展，可以保存的材料范圍也在不斷擴大。目前，超低溫保存技術(shù)面臨的問題主要有以下幾點：①超低溫保存技術(shù)雖然已經(jīng)成功地應(yīng)用于上百種植物，保存的材料也非常廣泛，但沒有形成普遍適用于各種植物的超低溫保存技術(shù)體系，有的研究是一個材料一個方法，換個新材料，方法就要重新摸索一遍，這也是整個超低溫保存的瓶頸，限制了大規(guī)模實際應(yīng)用。應(yīng)加強超低溫保存技術(shù)的研究，特別是廣譜的保存方法。②目前超低溫保存的研究多側(cè)重于保存技術(shù)的試驗，對凍存機理的研究尚不深入。下一步應(yīng)加大分子機理的研究。③中國大部分李亞科植物都分布在北溫帶地區(qū)，相比于離體莖尖來說，休眠芽更容易得到，具有更省時、省力、節(jié)約成本的優(yōu)勢。因此，加強休眠芽的研究是非常重要的。④果樹病毒病已嚴(yán)重危害果樹產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，要利用好超低溫療法，加強病毒脫除機理研究的同時解決產(chǎn)業(yè)問題。