豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲及機械化麩曲中的糖和糖醇

王晨晶，范文來*，徐巖，何松貴，劉幼強

1(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江南大學 生物工程學院，釀造微生物與應(yīng)用酶學研究室，江蘇 無錫， 214122) 2(廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山，528203)

釀造豉香型白酒的傳統(tǒng)餅曲是小曲中的“酒餅”曲，通常以餅丸接種，與浸泡蒸煮后的大米、黃豆等原料混合攪拌，壓制成曲餅，懸掛培養(yǎng)，干燥后在酒餅倉中貯藏[1]。豉香型白酒在制曲機械化過程中，通常采用圓盤制曲機制曲，通過添加麩皮減少大米黏性，此為“麩曲”或“散曲”，仍以餅丸接種，培養(yǎng)過程中通過鼓風調(diào)節(jié)溫度及濕度。目前，釀酒生產(chǎn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)麩曲和餅曲釀造的酒在感官品質(zhì)上是有差異的。

糖類物質(zhì)是曲中微生物生長繁殖的重要營養(yǎng)源，并影響著微生物的代謝產(chǎn)物[2]。目前對曲中糖的研究報道較少，小曲特別是豉香型餅曲的相關(guān)研究還未見報道。現(xiàn)有研究主要集中在微生物領(lǐng)域及揮發(fā)性香氣組分上[3-4]，僅有石亞林[5]等曾對大曲及其發(fā)酵過程的糖及糖醇進行了詳細分析。

糖及糖醇的常用分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、氣相色譜法(GC)、裂解氣相色譜法(pyrolysis gas chromatography, PGC)、高效陰離子交換色譜-脈沖安培法(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD)[7]等方式，通常與質(zhì)譜儀(MS)及核磁共振儀(NMR)等多種分析手段聯(lián)用。衍生化法結(jié)合氣相色譜的分析方法以其高分辨率、高靈敏度及簡單易行的優(yōu)勢為多種化合物的同時分析提供了可能，并在大曲研究中得到有效應(yīng)用[5]。

為進一步了解豉香型酒曲中糖類物質(zhì)的組成，本研究采用肟化-硅烷化衍生并結(jié)合GC-MS方法對豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲及機械化麩曲中的糖及糖醇進行研究，以期對豉香型酒曲中糖類化合物以及2種工藝的酒曲差異有初步認識，對改進傳統(tǒng)制曲和麩曲工藝，提高曲的品質(zhì)提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

樣品：傳統(tǒng)工藝餅曲及機械化麩曲成品曲均取自廣東九江酒廠，各取5個批次，按照5點取樣法取樣，粉碎后混合均勻并于-20 ℃貯藏。

試劑：鹽酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈(色譜純)；六甲基二硅胺烷(hexamethyldisilazane，HMDS)(色譜純)；三氟乙酸(色譜純)；吡啶(色譜純)；L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、半乳糖、麥芽糖、D-纖維二糖、海藻糖、龍膽二糖、甘油、L-蘇糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、D-阿拉伯糖醇、核糖醇、D-松醇、D-半乳糖醇、myo-肌醇、D-甘露醇及水楊苷(內(nèi)標，IS)(色譜純)，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BZFS-02粉碎機，西安寶正實業(yè)有限公司；色譜-Trace1310 質(zhì)譜-TSQ8000，Thermo Scientific；Organomation N-EVAP氮吹儀，安捷倫；純水機，MolliQ SYNERGY；Avanyi J-E高速冷凍離心機，貝克曼；Centrifuge 5418 離心機，Eppendorf；SB-25-12D超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水分測定

年輕刑警歪著脖子慢條斯理地說，編啊，繼續(xù)編?。磕闶遣皇瞧ず凸穷^發(fā)癢了，要我給松松？你以為我們是吃干飯的不是？年輕刑警又一拍桌子說，老實交代，為什么要編？

參照QB/T 4247—2011[8]進行曲樣水分測定。

1.3.2 糖和糖醇提取

將樣品粉碎，過80目篩并混合均勻，稱取5.00 g曲粉置于50 mL燒杯中，加入25 mL 0.1 mol/L 的HCl水溶液過夜浸泡；冰水浴超聲提取1 h，并于4 ℃、10 000 r/min下離心30 min ，上清液再用0.45 μm水系膜過濾；收集濾液，并向其中加入等體積乙腈沉淀蛋白，離心除蛋白后取上清液于4 ℃儲存[9]。

1.3.3 肟化-硅烷化衍生

參考ANA等人的方法[10]，采用兩步衍生法。吸取150 μL大曲浸提液置于2 mL氣相小瓶中，加入150 μL質(zhì)量濃度為882 mg/L的內(nèi)標水楊苷，氮氣吹干；然后向小瓶中加入150 μL 2.5%(體積分數(shù))鹽酸羥胺吡啶，于密閉環(huán)境下75 ℃反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后再向小瓶中加入95 μL HMDS及10 μL三氟乙酸，45 ℃密閉反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后，待樣品冷卻至室溫，將其移至1.5 mL離心管中，于室溫12 000 r/min離心3 min；樣品在衍生反應(yīng)后24 h內(nèi)進行GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS條件

色譜柱：TG-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：65 ℃保持2 min，6 ℃/min升溫到280 ℃，保持10 min；進樣口溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，載氣為氦氣，流速1 mL/min，分流比10∶1，進樣量1 μL。EI電離源，電子能量70 eV，發(fā)射電流25 μA，離子源溫度300 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～650 amu[5]。

1.3.5 定性及定量

2 結(jié)果與討論

2.1 糖及糖醇定性與定量分析方法

還原糖先經(jīng)甲肟化反應(yīng)然后進行硅烷化衍生處理，形成anti-((E)-)和syn-((Z)-)型同分異構(gòu)體，同一化合物色譜圖出現(xiàn)2個峰，鑒定時依據(jù)該化合物2個保留指數(shù)鑒定(如圖1和表1)；將同一物質(zhì)2個峰面積相加用于該物質(zhì)定量分析。曲中還原糖如L-阿拉伯糖(6 和8號峰)、D-葡萄糖(13和14號峰)等單糖及麥芽糖(20和21號峰)、纖維二糖(18和19號峰)、龍膽二糖(22和23號峰)等二糖，均為二個色譜峰；非還原糖(如海藻糖)和糖醇均為單個色譜峰[11](見圖 1)。

1-甘油；2-赤蘚糖醇；3-L-阿拉伯糖醇；4-核糖醇；5和7-D-木糖；6和8-D-阿拉伯糖；9-D-松醇；10-D-甘露醇；11-D-半乳糖醇；12和15-半乳糖；13和14-D-葡萄糖；16-myo-肌醇；17-海藻糖；18和19- D-纖維二糖；20和21-麥芽糖；22和23-龍膽二糖圖1 豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲中糖及糖醇衍生后GC-MS圖Fig.1 GC-MS of silylated sugars and sugar alcohols in traditional Bingqu for Chixiang aroma type liquor

所有待測定化合物標準曲線R2在0.984～0.997之間；相對標準偏差(RSD)在2%～11%；樣品回收率在81%～116%(見表 1)。

表1 糖及糖醇RI、定量離子、標準曲線、R2、LOD、LOQ、回收率、RSD(n=3)及線性范圍Table 1 The RI, m/z, calibration curves, R2, LOD, LOQ, recovery, RSD and linearity range of sugars and sugar alcohols

續(xù)表1

化合物RIm/z斜率截距R2LOD/(μg·L -1)LOQ/(μg L -1)回收率/%RSD/%線性范圍/(mg·L -1)D-纖維二糖D-Cellobiose2 8672 8942070.026 90.1430.99210.434.78830.170～44.5海藻糖Trehalose2 8163610.033 67.50×10-20.9939.3231.19924.06～1 038龍膽二糖Gentiobiose2 9873 0192040.068 30.1180.99518.758.511690.142～73.8甘油Glycerol1 2881470.012 84.27×10-20.9898.9630.79723.85～987L-蘇糖醇、L-Threitol15221470.1765.00×10-40.9967.7225.78450.221～56.6赤蘚糖醇meso-Erythritol15311470.012 06.48×10-20.99111.739.08190.195～100木糖醇Xylitol1 7302170.6560.7920.9843.7211.29940.200～101D-阿拉伯糖醇D-Arabitol1 7512170.013 40.1190.9928.2132.010784.16～1 064核糖醇Adonitol1 7582170.011 94.65×10-20.9966.2018.010583.90～997D-松醇D-Pinitol1 8682171.440.3150.9974.0512.211450.270～139D-半乳糖醇D-Dulcitol1 9852050.9490.3720.9929.0827.28160.392～204myo-肌醇myo-Inositol2 1302170.7330.3050.9974.5213.510740.205～117D-甘露醇D-Mannitol1 9692050.989-0.1110.99616.652.19190.052 1～26.7

2.2 傳統(tǒng)工藝餅曲與機械化麩曲中糖及糖醇

在餅曲和麩曲中共檢測到4種單糖、4種二糖、9種糖醇及甘油(如表 2)。在所有檢測到的物質(zhì)中，含量最高的是D-葡萄糖，其次為海藻糖及甘油，這3種物質(zhì)占整個總量67.8%(餅曲)～71.7%(麩曲)。根據(jù)物質(zhì)類別分析，單糖含量最高，占整個總量56.7%(餅曲)～68.5%(麩曲)，其次為二糖，占13.6%(麩曲)～21.2%(餅曲)，再次是糖醇，占12.2%(麩曲)～15.7%(餅曲)，甘油占5.70%(麩曲)～6.40%(餅曲)。

餅曲中檢測到單糖主要有L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖及半乳糖，含量最高的是D-葡萄糖，達16.5 mg/g絕干曲，占單糖總量82.8%(餅曲)，占所有糖及糖醇總量47.0%(餅曲)。麩曲中含量最高的單糖也是D-葡萄糖，含量為21.8 mg/g絕干曲，占麩曲單糖總量88.3%，占麩曲所有糖及糖醇總量60.6%。

餅曲中二糖檢測到海藻糖、麥芽糖、龍膽二糖及D-纖維二糖4種，含量最高的為海藻糖，高達5.14 mg/g絕干曲，占二糖總量69.1%(餅曲)，占所有糖及糖醇總量21.1%。麩曲中麥芽糖與海藻糖含量接近，麥芽糖占麩曲二糖總量38.0%，海藻糖占麩曲二糖總量40.1%。

表2豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲及機械化麩曲中糖及糖醇含量Table 2 The content of sugars and sugar alcohols in Chixiang traditional Bingqu and mechanical-making moldy bran

餅曲中糖醇共檢測到9種，雖然種類高于單糖與二糖之和，但總含量較低，僅為5.53 mg/g絕干曲。餅曲及麩曲的糖醇類物質(zhì)中均為赤蘚糖醇含量最高，在餅曲中達到1.89 mg/g絕干曲，占糖醇總量34.1%；在麩曲中為1.55 mg/g絕干曲，占糖醇總量35.2%。

非還原性的二糖海藻糖及一系列多元醇如甘油、D-阿拉伯糖醇、山梨糖醇及D-甘露醇等具有穩(wěn)定、抗逆等作用[12-13]。海藻糖在酵母、霉菌及細菌中可由D-葡萄糖、麥芽糖等產(chǎn)生，D-阿拉伯糖醇可由葡萄糖代謝生成[14]，還可在酵母細胞中由甘油生成[15]。

2.3 傳統(tǒng)工藝餅曲與機械化麩曲糖及糖醇差異

總體上講，與傳統(tǒng)工藝餅曲相比，機械化麩曲單糖總量較高，單糖總量上升23.6%；而二糖及糖醇總量較低，二糖總量下降34.4%，糖醇總量下降20.5%。

與餅曲相比，麩曲含量明顯上升的物質(zhì)有D-葡萄糖、麥芽糖、D-松醇和myo-肌醇，麥芽糖上升129%，D-松醇上升117%，myo-肌醇上升93.9%，D-葡萄糖含量上升了31.9%；L-蘇糖醇、D-阿拉伯糖醇及海藻糖在麩曲中下降明顯，L-蘇糖醇含量下降80.3%，D-阿拉伯糖醇下降69.8%，海藻糖下降62.0%。甘油下降了8.50%。

差異產(chǎn)生的原因可能是由于兩種工藝下曲中微生物和酶系所處的環(huán)境不同，消耗淀粉質(zhì)原料、葡萄糖并引起海藻糖及糖醇累積的途徑不同[13]，這些物質(zhì)的含量差異從一個側(cè)面反映了餅曲與麩曲發(fā)酵過程中微生物生長代謝的差異，也反映了2種曲品質(zhì)的差異。

2.4 傳統(tǒng)工藝餅曲與大曲糖類及糖醇比較

豉香型傳統(tǒng)工藝曲是以大米為原料的餅曲，與以小麥為主要原料的大曲在原料配方及工藝上均有較大差異，因而這二者的成分差異較大。

文獻報道大曲中檢測到的糖類及糖醇物質(zhì)共13種[5, 16]，本研究在豉香型小曲中共檢測到17種，其中D-纖維二糖、龍膽二糖、D-松醇、L-蘇糖醇及D-半乳糖醇在大曲研究中未見報道，而在豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲中未檢測到山梨糖醇。濃、清、醬三大香型大曲中游離態(tài)糖及糖醇總量41.5～61.3 mg/g絕干曲[9]，均高于豉香型餅曲(35.2 mg/g絕干曲)。

豉香型餅曲中海藻糖含量是這4種酒曲中最高的，是濃香型大曲(0.150 mg/g絕干曲[9])的34.3倍，醬香型大曲(0.750 mg/g絕干曲[9])的6.86倍，清香型大曲(3.64 mg/g絕干曲[9])的1.4倍。豉香型餅曲中D-甘露醇小于定量限，而濃香及醬香大曲中該物質(zhì)含量均超過10 mg/g絕干曲[9]。核糖醇在豉香型餅曲中含量僅為0.931 mg/g絕干曲，而在大曲中含量達7.74～12.5 mg/g絕干曲[9]，大曲中核糖醇含量是豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲的8.32～13.5倍。甘油在濃、清、醬3種大曲中含量7.35～13.6 mg/g絕干曲[9]，豉香型餅曲中僅為 2.24 mg/g絕干曲。

海藻糖、D-甘露醇、核糖醇、山梨糖醇及甘油在豉香型餅曲和大曲中的含量差異可能由于不同工藝下微生物的代謝通路不同、制曲原料不同造成的。這些差異對曲的品質(zhì)到底有什么影響，還需要進一步的研究。

3 結(jié)論

本研究分析了豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲及機械化麩曲中的糖及糖醇，首次在酒曲中檢測到龍膽二糖、D-纖維二糖、D-松醇、L-蘇糖醇及D-半乳糖醇。在豉香型傳統(tǒng)工藝餅曲與機械化麩曲中，單糖含量最高而糖醇種類最多。在所有檢測到的物質(zhì)中，含量最高的是D-葡萄糖，其次為海藻糖及甘油。2種曲中L-蘇糖醇、D-阿拉伯糖和海藻糖含量差異最大；餅曲與大曲的區(qū)別則主要反映在豉香型餅曲糖及糖醇總量低，D-甘露醇、核糖醇、山梨糖醇及甘油含量低，海藻糖含量高。綜合分析，高含量的海藻糖是豉香型餅曲不同于豉香型麩曲及大曲的典型特征。