超聲輔助高速均質(zhì)制備人乳脂類似物乳液工藝優(yōu)化

楊溶，覃小麗，楊貴妃，鐘金鋒，劉雄

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

傳統(tǒng)嬰幼兒配方乳液中的油脂配料(植物油和牛乳脂)雖與人乳脂在脂肪酸組成上接近，但在甘油酯結(jié)構(gòu)上仍存在較大差異，這種差異易造成脂肪酸(能量)和鈣的雙重?fù)p失[1-2]。近十年來(lái)，利用酶法催化動(dòng)植物油獲得富含1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油酯(1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO)的人乳脂類似物(或人乳脂替代品)是嬰幼兒配方乳液研究的熱點(diǎn)之一[3-5]。相比傳統(tǒng)嬰幼兒配方乳液中油脂配料，人乳脂類似物富含OPO，使脂肪酸易于吸收，能減少不溶性鈣皂并改善腸道健康[6-8]。目前，以人乳脂類似物作為新一代嬰幼兒配方乳液的油基，制備的人乳脂類似物乳液有較好的前景；然而，該方面的研究還較少[9]。

嬰幼兒配方乳液通常采用高壓均質(zhì)技術(shù)獲得，如DRAPALA等[10]以大豆油為油基采用兩步高壓均質(zhì)法制備嬰幼兒配方乳液，重點(diǎn)研究了水解乳清蛋白和麥芽糖糊精的結(jié)合物對(duì)乳液熱穩(wěn)定性的影響；ZOU等[11]以酶法制備的結(jié)構(gòu)脂為芯材采用高壓均質(zhì)法(34.47～48.26 MPa)制備嬰幼兒配方乳液，研究了抗氧化劑對(duì)該乳液氧化穩(wěn)定性的影響。超聲輔助高速均質(zhì)乳化法具有操作簡(jiǎn)單，形成乳液粒徑小、分布窄，高穩(wěn)定性等特點(diǎn)[12-16]。然而，關(guān)于利用超聲輔助高速均質(zhì)乳化法制備嬰幼兒配方乳液的研究尚未見報(bào)道，乳液的形成規(guī)律尚未明確。

本研究以更為經(jīng)濟(jì)的分提方式制得富含OPO的豬油，同其他油料調(diào)配獲得人乳脂類似物，并以此為分散相，通過(guò)對(duì)人乳脂類似物乳液的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，重點(diǎn)考察了蛋白質(zhì)、人乳脂類似物和磷脂的添加量以及超聲時(shí)間、功率對(duì)乳液形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白(CAS# 9006-59-1，純度為81.47%)、酪蛋白(CAS# 9000-71-9)和大豆卵磷脂(CAS# 8002-43-5),合肥博關(guān)生物科技有限公司；37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(CRM 47885)，Sigma-Aldrich(中國(guó))公司；大豆油，重慶紅蜻蜓油脂有限責(zé)任公司；豬油，重慶市北碚區(qū)天生路永輝超市；油茶籽油，江西春源綠色食品有限公司；椰子油，上海冉浩實(shí)業(yè)有限公司；豬胰脂肪酶(CAS# 9001-62-1)，合肥博美生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙醚、正己烷、石油醚、甲醇、KOH、膽酸鈉、HCl等試劑均為分析純，重慶市鈦新化工公司；超純水,由東莞亞仕蘭YSL-RO-15L/H型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制得。

1.2 儀器與設(shè)備

BZY-3B型自動(dòng)表/界面張力儀，上海衡平儀器儀表廠；Zetasizer Nano ZS90型激光粒徑儀，英國(guó)Malvern公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速均質(zhì)機(jī)、RW20 DIGITAL型電動(dòng)攪拌機(jī)、Topolino型磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；JY98-IIIDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；MX-S可調(diào)式漩渦振蕩器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；GC-2010型氣相色譜儀，日本島津科技有限公司；PB-10 標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)，德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人乳脂類似物的調(diào)配

根據(jù)人乳脂的脂肪酸結(jié)構(gòu)、組成以及人乳脂類似物調(diào)配數(shù)學(xué)模型[17]，以33L-豬油(經(jīng)干法分提得到33 ℃呈液體部分)為基礎(chǔ)油料，與油茶籽油、大豆油和椰子油進(jìn)行調(diào)配得到人乳脂類似物，采用氣相色譜測(cè)定其脂肪酸組成與分布。將其充入氮?dú)獗４嬗?20 ℃，用于制備人乳脂類似物乳液。

1.3.2 乳液的制備

采用超聲輔助高速均質(zhì)法制備人乳脂類似物乳液。首先，制備水相，分別稱取一定質(zhì)量的磷脂、乳清蛋白、酪蛋白于燒杯中，加超純水于30 ℃下磁力攪拌2 h，添加疊氮化鈉溶液(最終濃度為0.02%)抑菌，調(diào)節(jié)水相的pH值為6.8，置于4 ℃靜置12 h使其中的蛋白質(zhì)充分溶脹。然后，將一定質(zhì)量的人乳脂類似物添加于水相，攪拌(500 r/min，5 min)后高速均質(zhì)(20 000 r/min，2 min)，獲得粗乳液。最后，采用超聲處理粗乳液(工作時(shí)間為5 s，間歇3 s)，用冰水浴使溫度不超過(guò)30 ℃，得到的人乳脂類似物乳液用于后續(xù)粒徑、分布系數(shù)(polydispersity index，PDI)、zeta電位、表面張力和外觀觀察等性能表征。

表1 均勻設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of uniform design

根據(jù)GB 10767—2010 《較大嬰幼兒配方食品》 中規(guī)定[18]：即食狀態(tài)下較大嬰幼兒配方食品每100 mL所含能量應(yīng)不低于250 kJ，且每100 kJ能量中蛋白質(zhì)為0.7～1.2 g，脂肪為0.7～1.4 g。與前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，確定考察因素及范圍：超聲時(shí)間(2～32 min)，超聲功率(60～660 W)，蛋白質(zhì)(1.75%～3.1%，基于乳液的總質(zhì)量計(jì)算的質(zhì)量分?jǐn)?shù))、人乳脂類似物(1.75%～3.55%，基于乳液的總質(zhì)量計(jì)算的質(zhì)量分?jǐn)?shù))和磷脂(0.05%～0.5%，基于乳液的總質(zhì)量計(jì)算的質(zhì)量分?jǐn)?shù))，用DPS 7(data processing system 7)數(shù)據(jù)系統(tǒng)處理U12(122×53) 混合水平均勻設(shè)計(jì)方案，因素水平見表1。探究不同因素對(duì)人乳脂肪類似物乳液的粒徑、zeta電位、PDI和表面張力的影響。

1.3.3 檢測(cè)方法

1.3.3.1 人乳脂類似物的總脂肪酸組成測(cè)定

采用KOH-甲醇酯化法對(duì)人乳脂類似物進(jìn)行甲酯化，具體操作參考胡燁敏等[19]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確吸取10 μL油料于15 mL離心管中，加入2 mL正己烷，振蕩樣品充分溶解；加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液，于45 ℃條件下充分振蕩5 min，靜置5 min，加入6 mL飽和NaCl溶液，搖勻10 s后離心(5 000 r/min，5 min)，吸取上層正己烷(含脂肪酸甲酯)，待氣相色譜檢測(cè)。氣相色譜的檢測(cè)條件：色譜柱：DB-23毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：N2；流量：1.0 mL/min；分流比為50∶1；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；FID 檢測(cè)器溫度為280 ℃；初始柱溫度為60 ℃，以7 ℃/min升至220 ℃，保持35 min。以37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品為參考，并采用面積歸一法計(jì)算脂肪酸的相對(duì)含量。

1.3.3.2 人乳脂類似物的sn-2位脂肪酸組成測(cè)定

參照覃小麗等[20]的方法，以酶法水解油樣并采用硅膠薄層層析法對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分離，獲得sn-2位單甘酯進(jìn)行甲酯化和氣相分析，方法條件和步驟見1.3.3.1。

1.3.3.3 乳液的粒徑、PDI及zeta電位的測(cè)量

采用Zetasizer Nano ZS 90激光粒徑儀測(cè)定人乳脂類似物乳液的粒徑、PDI和zeta電位情況。為了盡量降低多重光散射效應(yīng)，將乳液用超純水稀釋1 000倍。水相溶液的折射率設(shè)置為1.33，測(cè)試溫度為25 ℃，平衡時(shí)間為2 min。樣品平行測(cè)定兩組，每組測(cè)定3次，每次測(cè)量值為13個(gè)子測(cè)試運(yùn)行結(jié)果的平均值。

1.3.3.4 表面張力的測(cè)定

采用表面張力測(cè)量?jī)x在(23±1)℃下測(cè)定乳液的表面張力。取一定體積乳液加入樣品池中，調(diào)節(jié)粗調(diào)旋鈕、微調(diào)旋鈕使鉑金片與乳液接觸，并讀取數(shù)值。每個(gè)樣品至少重復(fù)測(cè)定3次，確保證測(cè)量差值在1 mN/m以內(nèi)。

1.3.3.5 乳液的外觀

將鮮乳液裝入10 mL螺口玻璃瓶，在25 ℃下靜止放置，定期觀察人乳脂類似物乳液體系的變化，包括是否有油滴析出、絮凝沉淀、乳液分層等現(xiàn)象。觀察若干天，文字記錄現(xiàn)象并拍照。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本研究對(duì)多組間平均值的比較采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA 及Duncan分析，p<0.05為顯著性差異，并采用DPS 7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)均勻設(shè)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人乳脂類似物的脂肪酸組成與分布

人乳脂的脂肪酸組成及其分布是制備人乳脂類似物的黃金原則[21]，選擇4種油料(油茶籽油、大豆油、椰子油、33L-豬油)進(jìn)行調(diào)配得到人乳脂類似物。由表2可看出，油茶籽油富含不飽和脂肪酸(如C18∶1n-9和C18∶2n-6總脂肪酸含量分別為79.63%和7.70%)作為人乳脂類似物中不飽和脂肪酸的主要來(lái)源。椰子油富含中碳鏈脂肪酸，其中C10∶0和C12∶0總脂肪酸含量分別為6.04%和53.37%，為人乳脂類似物提供中碳鏈脂肪酸。大豆油含有較豐富的必需脂肪酸(如C18∶3n-3總脂肪酸含量為5.15%，C18∶2n-6總脂肪酸含量可達(dá)53.56%)，有助于調(diào)節(jié)人乳脂類似物中C18∶2n-6/C18∶3n-3值，人乳脂中C18∶2n-6/C18∶3n-3的比值在5～15時(shí)有助于嬰兒的智力發(fā)育和視力[22]。

表2 各種油脂的總脂肪酸組成 單位：%

注：C10∶0為癸酸；C12∶0為月桂酸；C14∶0為肉豆蔻酸；C16∶0為棕櫚酸；C18∶0為硬脂酸；C18∶1n-9為油酸；C18∶2n-6為亞油酸；C18∶3n-3為亞麻酸；—表示未檢出。表3同。

表3 各種油脂的sn-2位脂肪酸組成 單位：%

豬油由于其特殊的脂肪酸組成和甘油酯結(jié)構(gòu)是制備人乳脂類似物的最佳原料之一。由表2和表3可知，33L-豬油中C16∶0總脂肪酸和sn-2位脂肪酸含量分別為25.76%和69.25%，由此可知sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量可達(dá)89.61%；C18∶1n-9總脂肪酸和sn-2位脂肪酸含量分別為36.42%和10.52%，由此可計(jì)算其在sn-1,3位的相對(duì)含量90.37%。這提示該33L-豬油富含OPO，能夠從甘油三酯結(jié)構(gòu)層面上為制備與人乳脂高度相似的人乳脂類似物提供保障。

結(jié)合上述，根據(jù)4種油的脂肪酸組成及分布的特點(diǎn)，以及人乳脂的脂肪酸組成及分布的準(zhǔn)則[1]，采用軟件SPSS 18計(jì)算上述4種原料油脂，按比例(19.78%油茶籽油、15.15%大豆油、10.28%椰子油和50.80% 33L-豬油)進(jìn)行調(diào)配得到人乳脂類似物。由表2可知，人乳脂類似物中總脂肪酸含量均在人乳脂的參考范圍內(nèi)，其中C18∶2n-6/C18∶3n-3的比值為12.82。此外，結(jié)合表2、表3可計(jì)算出人乳脂類似物中sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量可達(dá)67.03%，與人乳脂中sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量(>70%)接近，這表明調(diào)配制備的人乳脂類似物在脂肪酸結(jié)構(gòu)上與人乳脂具有較好的相似性。人乳脂類似物在其制備工藝(經(jīng)干法分提獲得的33-L豬油為基礎(chǔ)調(diào)配獲得)上，與酶法合成的OPO相比，具有簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)勢(shì)。

2.2 人乳脂類似物乳液的影響因素

以5個(gè)因素(蛋白質(zhì)、人乳脂類似物和磷脂的添加量及超聲時(shí)間和功率)為自變量，采用均勻設(shè)計(jì)對(duì)超聲輔助高速均質(zhì)法制備人乳脂類似物乳液形成的影響因素進(jìn)行探討，結(jié)果見表4。并通過(guò)DPS 7軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸處理，建立指標(biāo)模型概況見表5。

表4 混合均勻設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Design of mixed uniform and experimental results

表5 指標(biāo)模型概況Table 5 Summary of the model parameters

由均勻設(shè)計(jì)結(jié)果可知，乳液的PDI(0.17～0.23)和Zeta電位(-37.0～-40.2 mV)變化范圍較小，且有研究表明PDI<0.2 和Zeta電位小于-30 mV，乳液粒徑分布比較均一，單體聚合的穩(wěn)定性良好[23-24]，故不選擇以PDI和Zeta電位為指標(biāo)進(jìn)行乳液制備條件的優(yōu)化。此外，鑒于乳液粒徑在均勻設(shè)計(jì)組中變化幅度(約63 nm)較大，所以選取粒徑的模型進(jìn)行最佳條件的確定。對(duì)粒徑回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到預(yù)測(cè)的優(yōu)化條件：超聲功率為108 W，超聲時(shí)間為32 min，蛋白質(zhì)添加量為2.76%，人乳脂類似物添加量為1.75%，磷脂添加量為0.5%。

2.3 最佳工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)，得到的人乳脂類似物乳液粒徑為(169.5±1.30 )nm(n=3)，與預(yù)測(cè)值(173.8 nm)相吻合。對(duì)該乳液進(jìn)行19 d儲(chǔ)藏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，粒徑在7 d內(nèi)變化幅度不大(第7天的粒徑為184.7 nm)，而之后的儲(chǔ)藏中，粒徑上升趨勢(shì)較陡峭并在19 d后到達(dá)283.9 nm，說(shuō)明乳液在7 d內(nèi)穩(wěn)定性較好；此外，乳液在儲(chǔ)藏過(guò)程中，其PDI和zeta電位變化均較小，且都在可接受范圍內(nèi)(圖1)。

圖1 儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)人乳脂類似物乳液粒徑、PDI和Zeta電位的影響Fig.1 Effect of storage time on average particle size, PDI and Zeta potential of human milk fat analogue emulsion注：圖1中不同小寫字母表示組間平均值有顯著差異(p<0.05)。

由圖2可得，比較第1天和第19天的粒徑分布，表明第19天相對(duì)第1天的粒徑分布圖向右偏移，可能是由于乳液的液滴之間相互聚集導(dǎo)致粒徑偏大，與圖1中粒徑變化趨勢(shì)一致。

此外，儲(chǔ)藏19 d后乳液外觀未出現(xiàn)明顯分層，只是液面上出現(xiàn)一層非常薄的乳白色絮狀物，這可能由于乳液中部分粒徑較大的液滴發(fā)生聚集而形成?？傊ㄟ^(guò)超聲輔助高速均質(zhì)法可獲得物理穩(wěn)定的人乳脂類似物乳液，為后續(xù)研究嬰兒配方乳液的功能調(diào)控提供技術(shù)支持。

圖2 第1天和第19天人乳脂類似物乳液粒徑分布和外觀圖Fig.2 Particle size distribution and appearance of human milk fat analogue emulsion at 1 and 19 day

3 總結(jié)

本研究以33-L豬油(富含OPO)為主要油料調(diào)配成人乳脂類似物，脂肪酸組成與人乳脂類相近，并且其sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量可達(dá)67.03%，C18∶1n-9在sn-1,3位的相對(duì)含量78.28%，這說(shuō)明人乳脂類似物在脂肪酸的結(jié)構(gòu)上能更好地模擬人乳脂。以上述人乳脂類似物為油脂芯材，采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輔助高速均質(zhì)法制備人乳脂類似物乳液，建立了影響乳液粒徑的條件優(yōu)化模型，獲得的乳液最小粒徑可達(dá)169.5 nm。對(duì)該模型進(jìn)行分析可知，影響乳液粒徑的主要因素為超聲時(shí)間和蛋白質(zhì)的添加量；在一定范圍內(nèi)，延長(zhǎng)超聲時(shí)間和增加蛋白質(zhì)含量有利于減小乳液的粒徑。通過(guò)采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化人乳脂類似物乳液的制備工藝可得到物理穩(wěn)定性好的乳液，以期為新一代嬰兒配方乳液的制備提供提供重要理論依據(jù)和技術(shù)支持。