梨自交花粉原位萌發(fā)觀察及不親和性強(qiáng)度研究

金子明，王國(guó)明，柯亞琪，石蘇利，吳 磊，谷 超

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210095)

薔薇科梨屬(PyrusL.)植物普遍存在由S基因位點(diǎn)控制的配子體型自交不親和(gametophytic self-incompatibility)現(xiàn)象，大多數(shù)品種表現(xiàn)為自花授粉不親和以及低結(jié)實(shí)率的特征[1]。大量研究表明，梨自花授粉不親和性主要是由花柱分泌的S糖蛋白引起的，這種S糖蛋白能夠分解自花授粉花粉管的RNA，導(dǎo)致花粉管停止生長(zhǎng)并進(jìn)入程序性死亡[2-3]。也有人認(rèn)為該反應(yīng)由S位點(diǎn)(S-locus)的1對(duì)S等位基因控制，即由雌蕊和花粉的S基因控制，分別為S-RNase、S-locusF-box/S-haplotype-specificF-box基因[4]。當(dāng)花粉的S基因與雌蕊的1對(duì)S等位基因之一的S基因相同時(shí)，自花花粉能夠在柱頭上萌發(fā)，但花粉管沿花柱向子房伸長(zhǎng)過程中會(huì)被花柱內(nèi)的S糖蛋白抑制，而不能完成受精坐果[5]，這種普遍存在的機(jī)制能夠抑制品種自交，促進(jìn)異花授粉。在各種自然因素的作用下，自交不親和植物也會(huì)發(fā)生自交親和性突變，一種是花柱突變，如日本梨品種奧嗄二十世紀(jì)是二十世紀(jì)(Nijisseiki，S基因型S2S4)的突變體，其中1個(gè)花柱S基因，即S42RNase基因發(fā)生變異，導(dǎo)致奧嗄二十世紀(jì)的花柱不能識(shí)別自己的花粉[6]。另一種自交親和性突變就是花粉發(fā)生突變，即花粉失去自交不親和(self-incompatibility，簡(jiǎn)稱SI)識(shí)別功能，而形成花粉SI突變體[5]。如吳華清等研究的金墜梨是鴨梨的芽變品種，金墜梨自花授粉結(jié)實(shí)率高達(dá)76%，自花的花粉管能正常生長(zhǎng)至花柱基部，由于花粉S基因發(fā)生突變，導(dǎo)致自交不親和性功能的喪失，表現(xiàn)出自花授粉能夠結(jié)實(shí)[7]。梨屬于配子體型自交不親和果樹，絕大多數(shù)品種自花授粉結(jié)實(shí)率極低，在生產(chǎn)上必須配置授粉樹以及花期人工輔助授粉，才能完成授粉受精，獲得經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，但是同時(shí)也增加了生產(chǎn)成本[4]。盡管如此，也常因授粉樹配置不合理、人工授粉不及時(shí)或是花期不良的氣候條件等問題影響授粉受精而造成減產(chǎn)[5]，而選育自花結(jié)實(shí)性品種是解決這些問題的重要途徑之一。加深對(duì)梨自交不親和性的研究，不僅有助于更好地了解這一生命現(xiàn)象，還可以為果樹育種和生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。同時(shí)為進(jìn)一步闡明梨自交親和性突變機(jī)制，深入研究自花花粉管被抑制的機(jī)制，從形態(tài)學(xué)角度探明花粉管在花柱中的生長(zhǎng)特性，以及不同品種自交不親和強(qiáng)度分析統(tǒng)計(jì)，為顯花植物防止自交衰退這一遺傳機(jī)制提供一些試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。因此，對(duì)不同品種的梨樹自交不親和性強(qiáng)度的研究，不僅具有理論價(jià)值，而且有潛在的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

本試驗(yàn)于2014年3月至2016年6月，分別于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梨資源圃和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦農(nóng)場(chǎng)園藝試驗(yàn)站梨資源圃內(nèi)進(jìn)行，共有256個(gè)品種進(jìn)行套袋處理。每個(gè)品種隨機(jī)選取6朵發(fā)育正常的并且處于大蕾期的花朵進(jìn)行硫酸紙?zhí)状幚怼４ㄩ_后花藥散粉時(shí)，輕輕搖動(dòng)紙袋或樹枝，使其自交授粉。為了確保每朵花自交授粉成功，從套袋后第2天起，每天搖動(dòng)紙袋或樹枝2次。5 d后采取套袋花朵，從基部截取花柱并迅速置于FAA(甲醛 、冰乙酸、70%乙醇體積比 5 ∶5 ∶90)固定液中，4 ℃保存。

1.2 花粉管原位熒光顯微觀察并拍照

花粉原位萌發(fā)的熒光顯微觀察技術(shù)參照吳巨友等的方法[8]，并稍有改動(dòng)：從FAA固定液中取出樣品，用蒸餾水多次清洗后，放入2 mol/L NaOH溶液中軟化，65 ℃水浴40 min，使組織軟化；再次清洗多次后，用0.1%苯胺藍(lán)水溶液(用0.1% K3PO4溶液配制)避光室溫染色4～6 h。多次清洗后，滴甘油壓片，用宏觀變倍體式熒光顯微鏡(型號(hào)：MVX10，日本OLYMPUS公司)觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Image-ProPlus6.0軟件測(cè)量花柱中花粉管的生長(zhǎng)長(zhǎng)度及其花柱的長(zhǎng)度，利用Excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算不同品種花粉管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度占花柱全長(zhǎng)的比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 坐果率調(diào)查

于2016年選取篩選后的梨品種進(jìn)行自花授粉坐果率調(diào)查。在開花前1周，對(duì)發(fā)育一致的花序進(jìn)行疏花，只留 2～3個(gè)生長(zhǎng)較好的花蕾，進(jìn)行套袋處理。盛花期輕輕搖動(dòng)套袋的花序，進(jìn)行自花授粉，每天搖動(dòng)紙袋或樹枝2次。分別在盛花后20、30 d統(tǒng)計(jì)坐果率，坐果率大于20%被認(rèn)為是自交親和[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉管生長(zhǎng)特性觀察

對(duì)梨不同品種花粉管原位熒光拍照觀察發(fā)現(xiàn)，花柱中花粉管分布及數(shù)量表現(xiàn)為上部較多、中部較少、下部最少的梯度分布(圖1-A、圖1-B)。部分自花授粉的花粉管停止生長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量的尖端膨大和彎曲等變形現(xiàn)象，與陳迪新等研究觀察結(jié)果一致[10](圖1-C、圖1-D)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)自交不親和性較強(qiáng)的品種花粉管雖然有少量穿過柱頭，但不能進(jìn)一步在花柱內(nèi)生長(zhǎng)，表現(xiàn)為花粉管在柱頭上為畸形狀、扭曲變形、先端膨大、雜亂無章等不親和性現(xiàn)象(圖1-E、圖1-F)。

2.2 梨自交不親和性強(qiáng)度

由于不同果樹樹種自交親和與不親和性的判定標(biāo)準(zhǔn)不同，且對(duì)于同一樹種不同研究者掌握的尺度也不同。張紹鈴等通過S糖蛋白含量高低來判斷自交不親和強(qiáng)度[11]。還有研究表明，自花授粉的花粉管在花柱中生長(zhǎng)長(zhǎng)度與其S糖蛋白含量顯著相關(guān)[12]。本研究根據(jù)自交授粉花柱中花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度占整個(gè)花柱的比例定義品種的自交不親和強(qiáng)度R值，通過對(duì)R值進(jìn)行分類，將梨供試品種的自交不親和強(qiáng)度分為強(qiáng)(強(qiáng)，0≤R≤30%)、中(中，30%

2.3 自交不親和強(qiáng)度R值分析

由于梨自交不親和的花粉能在柱頭上萌發(fā)并進(jìn)入花柱，但在花柱中的生長(zhǎng)受到抑制，不能完成受精，本試驗(yàn)對(duì)套袋處理的256個(gè)梨品種從基部截取花柱，染色拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，不同梨品種自交不親和性強(qiáng)度差異明顯，不親和性強(qiáng)度變幅為0～100%，自交不親和性強(qiáng)度R值強(qiáng)、中、弱參差不齊?；ǚ酃芸梢酝耆L(zhǎng)到基部，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)極可能為自交親和性的品種，只占調(diào)查總數(shù)的2.34%。本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)品種花粉管不能長(zhǎng)到基部(表1)，符合梨屬于自交不親樹種的基本屬性，說明梨屬于典型的自交不親和性植物。這6個(gè)不同梨品種的R值為100%，其中閆莊鴨梨[13]、秋榮[14]、54S-135[14]、金墜梨[7]、大果黃花梨[15]是已報(bào)道的自交親和性品種，而晚秀則是本試驗(yàn)通過自花花粉管發(fā)現(xiàn)的極可能為自交親和性品種。這些品種的花粉管能在自交花柱中生長(zhǎng)并長(zhǎng)至花柱底部，至于能否完成下一步受精及坐果過程，需對(duì)這些品種進(jìn)行進(jìn)一步自花套袋座果率調(diào)查。通過鑒定自交不親和強(qiáng)度R值，對(duì)后期自交親和性品種進(jìn)行了初步篩選。并且為后期探索花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度與自交不親和強(qiáng)度的深入研究提供了充足的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.4 不同梨品種自交不親和性強(qiáng)度R值頻度分布

對(duì)256個(gè)品種分析發(fā)現(xiàn)，其中自交不親和性強(qiáng)度為強(qiáng)的有147個(gè)，占所調(diào)查總數(shù)的57.4%；自交不親和性強(qiáng)度為中的有86個(gè)，占33.6%；自交不親和性強(qiáng)度為弱的有23個(gè)，占9.0%。從頻度分布角度分析，梨不同品種自交不親和強(qiáng)度主要趨于強(qiáng)與中，花粉管能長(zhǎng)到花柱基部的占少數(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了梨屬于配子體自交不親和植物(圖3)。對(duì)256個(gè)品種所屬系統(tǒng)歸類和對(duì)不同系統(tǒng)自交不親和性強(qiáng)度的分布頻度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，發(fā)現(xiàn)每個(gè)系統(tǒng)自交不親和性強(qiáng)度R值的強(qiáng)、中和弱分布符合所調(diào)查的整體規(guī)律，自交不親和性強(qiáng)的占大多數(shù)，而自交不親和性弱的僅占少數(shù)(表1、圖4)。同時(shí)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，西洋梨與砂梨系統(tǒng)自交不親和性強(qiáng)度R值弱的分布頻度較其他系統(tǒng)高(圖4)，為發(fā)現(xiàn)更多的自交親和性品種提供了方向。

表1 不同梨品種自交花柱中花粉管的生長(zhǎng)長(zhǎng)度占花柱的比例(R值)、自交不親和性強(qiáng)度分類及所屬系統(tǒng)

續(xù)表1

序號(hào)品種名R值(%)SI強(qiáng)度系統(tǒng)49蒼梧大沙梨0SP50崇化大梨0SB51初夏綠91.73WP52粗柄酥14.81SP53粗皮西絳塢41.79IP54脆綠7.10SH55大慈梨0SB56大果黃花100.00WP57大果酥梨0SB58大菊水54.99IP59大青67.10IN60大葉雪0SP61碭山酥梨11.90SB62冬果45.30IB63冬蜜19.58SH64凍花蓋0SU65豆梨13.51SZ66鵝梨61.26IB67鵝酥0SB68鄂梨1號(hào)69.83IH69鄂梨2號(hào)0SH70恩梨24.35SB71二宮白46.81IP72法蘭西0SC73樊山0SB74豐水A0SP75豐月0SN76甘川37.50IP77甘谷香水64.48IU78甘梨早60SH79甘梨早80SH80桂冠21.78SP81桂花梨76.09WP82漢源大白38.35IB83杭紅66.29IP84杭青7.82SP85紅安久0SC86紅巴梨B40.44IC87紅蓓蕾砂9.43SC88紅哈代0SC89紅考蜜斯9.34SC90紅茄梨10.96SC91紅山0SN92紅香26.96SP93紅香蜜0SB94紅香酥0SB95紅霄-10SB96紅星0SC97紅云2號(hào)0SP98花蓋22.34SU99花長(zhǎng)把57.83IX100華金35.73IH101華酥34.87IP

續(xù)表1

序號(hào)品種名R值(%)SI強(qiáng)度系統(tǒng)102華王0SP103黃金梨0SP104黃皮鄂梨0SP105黃茄梨60.26IP106黃色品種西洋梨86.06WC107黃縣長(zhǎng)把30.61IB108黃香37.36IB109會(huì)理早白0SP110金棒頭32.02IB111金川雪梨0SB112金川野生梨2號(hào)40.17IP113金二十世紀(jì)0SP114金花梨0SB115金水酥47.22IH116金星0SB117金墜100.00WB118錦豐20.20SB119錦香梨0SH120晉大50.98IN121京白梨10.87SU122酒泉長(zhǎng)把0SB123菊水10.02SP124君塚早生(褐皮)0SP125君塚早生(綠皮)0SP126康德0SP127考蜜斯18.60SC128孔德梨43.08IC129庫(kù)實(shí)0SN130蘭州軟兒梨21.08SU131蘭州長(zhǎng)把33.34IX132梨園麻子梨53.06IP133禮縣新八盤43.16IB134麗江面梨0SP135遼陽大香0SU136臨夏尕吊蛋0SX137臨夏黃麻66.46IX138六月黃棕梨0SP139六月爽0SN140六月酥20.00SB141龍泉190SH142龍泉44號(hào)51.90IP143龍團(tuán)梨19.42SP144隆回巨梨32.92IP145綠云28.25SP146麻梨23.35SU147滿豐52.43IP148滿園香0SU149茅盧庫(kù)介0SN150美人酥10.22SP151彌渡火把43.30IP152米黃23.26SN153面包梨0SN154明珠0SN

續(xù)表1

序號(hào)品種名R值(%)SI強(qiáng)度系統(tǒng)155南果梨45.32IU156南山糖梨1號(hào)62.65IP157南水0SP158南月23.78SP159糯稻42.83IP160蘋博香10.12SH161蘋果梨27.37SB162蘋香梨29.98SH163蒲梨宵28.85SP164浦瓜31.94IN165青松0SN166青云65.86IN167清玉25SP168秋黃61.67IP169秋榮100.00WP170秋月38.51IP171全州梨68.06IP172日光37.54IP173軟兒梨37.34IU174若光11.55SP175陜西紅金瓶0SN176上崗梨47.75IP177身不知37.32IH178盛馬44.52IC179十里香0SP180實(shí)生0SN181實(shí)生伏梨20.50SP182水洞瓜0SB183松島136.04IP184松島291.72WP185蘇門0SN186索美15.88SP187臺(tái)灣雪梨78.04WP188太白0SP189泰安長(zhǎng)把0SN190塘湖青32.75IP191天堂0SN192鐵農(nóng)1號(hào)0SH193鐵農(nóng)25號(hào)0SH194團(tuán)早梨45.61IP195晚咸豐25.32SP196晚秀100.00WP197威廉姆斯87.37WC198威寧自生梨0SP199吾妻錦25.53SP200五九香96.50WH201五三優(yōu)株15.15SP202武巴0SH203武山糖梨66.32IB204細(xì)花平頭青29.15SP205細(xì)皮西絳塢55.99IP206香梨0SP207香麻0SP

續(xù)表1

序號(hào)品種名R值(%)SI強(qiáng)度系統(tǒng)208湘菊0SP209新九梨22.30SN210新世紀(jì)73.45WP211新興0SP212新秀46.00IP213新鴨梨39.94IB214興矮二號(hào)55.92IP215興山10號(hào)0SP216興山15號(hào)26.06SP217興山16號(hào)53.56IP218興山34號(hào)21.56SP219興山8號(hào)22.86SP220幸藏55.99IP221雄古冬梨37.31IP222秀黃59.08IP223雪英56.22IH224鴨梨28.01SB225雅青68.49IH226閆莊鴨梨100.00WB227義烏子梨0SP228意大利7號(hào)0SC229油酥21.36SP230玉露香0SH231圓黃26.01SP232云和柿扁梨8.24SP233云林55.02IP234云南海東40.80IN235早冠94.58WH236早黃金52.75IP237早金酥0SH238早綠43.39IH239早三花0SP240早酥蜜0SB241早香脆31.12IB242長(zhǎng)把酥0SP243浙12-435.15IP244浙2113.61SP245蔗梨15.54SH246真鍮43.80IP247芝麻梨60.08IP248祗圓85.74WP249中矮3號(hào)15.32SZ250中翠7.93SH251中梨1號(hào)24.37SH252中梨3號(hào)18.81SH253重陽紅0SN254豬嘴巴24.84SP255筑波4967.37IP256筑水34.50IP

注：S(strong)代表自交不親和強(qiáng)度強(qiáng)的品種，I(intermediate)代表中強(qiáng)度的品種，W(weak)代表弱強(qiáng)度的品種，B代表白梨(P.brestschneideri)，C代表西洋梨(P.communis)，H代表種間雜交(interspecific hybridization)，N(unknow species)代表未知種類，P代表砂梨(P.pyrifolia)，U代表秋子梨(P.ussuriensis)，X代表新疆梨(P.sinkiangensis)，Z(stock species)代表砧木類型。

2.5 自花授粉坐果率統(tǒng)計(jì)調(diào)查

對(duì)于自交親和性強(qiáng)度極弱的，筆者選擇了R>90%的品種(金墜、秋榮、晚秀、五九香、早冠、初夏綠)進(jìn)一步探索自花授粉結(jié)實(shí)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金墜、秋榮、晚秀3個(gè)品種R值為100.00%，其中以已報(bào)道的自交親和品種金墜和秋榮作為對(duì)照。同時(shí)筆者也對(duì)自交不親和強(qiáng)度為中的早黃金、自交不親和強(qiáng)度為強(qiáng)的錦豐和六月爽多個(gè)品種進(jìn)行了自花套袋試驗(yàn)。表2結(jié)果表明，金墜和秋榮在花后20、30 d坐果率都高于20%，而其他品種自花套袋的品種基本沒有坐果。金墜和秋榮自花花粉管長(zhǎng)到花柱最低端，并且坐果率大于20%，說明金墜和秋榮為自交親和性品種，同時(shí)通過自交不親和強(qiáng)度R值來初步篩選自交親和性品種的可靠性得到了一定的驗(yàn)證。然而，并不是所有R值為100.00%的品種都是自交親和性品種，本試驗(yàn)中，初步鑒定晚秀R值為100.00%，但通過自花套袋發(fā)現(xiàn)坐果率為0。其他自交親和性強(qiáng)度為強(qiáng)與中的品種自花套袋不結(jié)實(shí)，或者結(jié)實(shí)率極低，為自交不親和品種，進(jìn)一步說明通過R值在海量的資源中初步篩選自交親和性品種方法的優(yōu)越性及可靠性。

表2 自花授粉后果實(shí)坐果率統(tǒng)計(jì)

3 討論

梨是薔薇科中自交不親和物種[16]，自花花粉可以在柱頭上萌發(fā)，但是很少能生長(zhǎng)到花柱底部[17-18]。本研究通過觀察不同品種自花花粉管在花柱內(nèi)停止生長(zhǎng)的位置差異發(fā)現(xiàn)，許多品種花粉萌發(fā)后生長(zhǎng)很短或者剛能穿過柱頭就完全停止生長(zhǎng)，表現(xiàn)為強(qiáng)自交不親和性，而大多數(shù)品種自花花粉管生長(zhǎng)停止在花柱長(zhǎng)度的2/3之前，這與前人的報(bào)道一致[17]。然而，仍有少量花粉管能夠生長(zhǎng)至花柱基部，表現(xiàn)為弱自交不親和性。每個(gè)花粉管數(shù)量在花柱中的分布從柱頭到基部越來越少，且絕大多數(shù)花粉管最終在花柱內(nèi)停止生長(zhǎng)，花粉管末端形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。有活體試驗(yàn)表明，不親和性花粉管生長(zhǎng)受抑制前，有彎曲、先端膨大變形等現(xiàn)象，而異花授粉的花粉管沒有此現(xiàn)象[10]。也有研究表明，自花授粉的花粉管在花柱內(nèi)都有“快—慢—快”的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)變化過程[10]。在不同的梨品種中花粉管生長(zhǎng)受到抑制時(shí)，花柱的發(fā)生部位及變化不同，徐義流等認(rèn)為可能是自交不親和基因時(shí)空表達(dá)的差異造成的[19]。也有研究表明，梨花柱中S糖蛋白的含量具有品種特異性和組織差異性，即品種不同，花柱中S糖蛋白的含量不同，并且S糖蛋白在花柱中分布不均勻?qū)е禄ǚ酃芡Ｖ股L(zhǎng)[12，20]。梨的自交不親和性主要表現(xiàn)在自交授粉花柱中花粉管的生長(zhǎng)受到抑制，這與S糖蛋白有直接的關(guān)系，S糖蛋白的核糖核酸酶活性可通過降解花粉管RNA來抑制花粉管生長(zhǎng)[21]?；铙w和離體試驗(yàn)均表明，自交不親和性強(qiáng)度與花粉管長(zhǎng)度呈負(fù)相關(guān)[11-12]。從而分析認(rèn)為，由花粉管生長(zhǎng)的長(zhǎng)度可以判斷自交不親和強(qiáng)度，自交花柱中花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度占花柱的比例將自交不親和強(qiáng)度分為強(qiáng)、中和弱3類。在本研究中256個(gè)品種中，自交不親和性強(qiáng)度參差不齊，強(qiáng)、中和弱頻度分布也有很大差距。在離柱頭近的地方S-RNase濃度可能較高，因此自交不親和性為強(qiáng)的頻度分布占多數(shù)，為梨不同品種花柱內(nèi)S糖蛋白總量及其花柱內(nèi)的分布提供一定的理論基礎(chǔ)。S糖蛋白在花柱內(nèi)是否具有梯度分布和怎樣的分布有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究同時(shí)為后期深入研究自交不親和性強(qiáng)度具體機(jī)制提供了充足的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

筆者通過對(duì)大量自花授粉花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)研究，來初步判斷篩選自交親和性品種。發(fā)現(xiàn)金墜、秋榮和晚秀花粉管長(zhǎng)到了花柱最底端，自交不親和強(qiáng)度R值為100.00%。進(jìn)一步自花套袋調(diào)查了坐果率，發(fā)現(xiàn)金墜和秋榮確實(shí)為自交親和性品種。然而遺憾的是，晚秀在鑒定花粉管過程中極可能是自交親和性品種，但最終自花套袋未結(jié)實(shí)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，自交不親和強(qiáng)度呈現(xiàn)中和強(qiáng)的品種，在自花套袋試驗(yàn)中也不結(jié)實(shí)。因此，這樣的結(jié)果驗(yàn)證了筆者通過自花花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)來初步篩選自交親和性品種的必要性和可靠性，大大減少了盲目調(diào)查坐果率的工作量，并且豐富了自交不親和強(qiáng)度R值數(shù)據(jù)，為后期進(jìn)一步研究自交不親和機(jī)制提供了充足的數(shù)據(jù)及一定的理論基礎(chǔ)。