布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0742基因的原核表達(dá)及功能分析

豆曉霞，劉 洋，李 敏，荊明龍，李明奇，王小鳳，陳創(chuàng)夫，張 輝

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

由布魯氏菌(Brucella)引起的布魯氏菌病(Brucellosis)是一種重要的人畜共患病，可造成動(dòng)物流產(chǎn)、死胎，生殖器官不對(duì)稱腫大，人類似流感狀的周期性波浪熱，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生健康，給世界經(jīng)濟(jì)帶來嚴(yán)重的損失[1]。布魯氏菌是屬于α-2變形菌家族的致病性革蘭氏陰性菌[2]，胞內(nèi)寄生和復(fù)制是布魯氏菌的主要毒力特征[3]。布魯氏菌不僅可以通過消化道黏膜和呼吸道黏膜進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，還可以通過皮膚、眼結(jié)膜等進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，并被宿主體內(nèi)的吞噬細(xì)胞吞噬[4]，雖然布魯氏菌可以在多數(shù)細(xì)胞內(nèi)寄生，但是其仍具有宿主特異性，該菌主要寄生在巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)[5]。布魯氏菌屬經(jīng)典的6個(gè)種屬分別為羊種布魯氏菌(B.melitensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、犬種布魯氏菌(B.canis)、綿羊種布魯氏菌(B.ovis)、沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)[6-8]，分別主要感染山羊和綿羊、牛、豬、狗以及嚙齒類動(dòng)物。最近又有4種布魯氏菌被鑒定出來，包括從海豹分離的鰭腳類布魯氏菌(B.pinnipediae)，從海豚分離的鯨種布魯氏菌(B.ceti)[9]，從紅狐、田鼠、土壤中分離的田鼠種布魯氏菌(B.microti)[10-12]，從乳腺移植病人分離的湖浪種布魯氏菌(B.inopinata)[13]。盡管犬種布魯氏菌和綿羊種布魯氏菌感染動(dòng)物，但人感染犬種布魯氏菌很罕見，人感染綿羊種布魯氏菌也未報(bào)道[14]，而羊種布魯氏菌和流產(chǎn)布魯氏菌是人感染的主要病原菌。目前，人感染布魯氏菌主要通過已經(jīng)感染的動(dòng)物(如綿羊，山羊，牛等一些家畜)以及動(dòng)物肉制品、奶牛津液(如尿液和乳汁)、污染奶制備的奶制品等。人通過污染的環(huán)境(如氣溶膠)以及傷口等途徑也可造成布魯氏菌病的傳染。值得一提的是，人在感染布魯氏菌平均3～4周后，初期會(huì)出現(xiàn)波浪熱，尤其是食欲不振、渾身無力、盜汗、體質(zhì)量減輕，偶爾還會(huì)出現(xiàn)頭痛，后期會(huì)伴發(fā)關(guān)節(jié)疼痛等。而初期的癥狀和感冒類似，往往會(huì)被誤認(rèn)為感冒，以至于延誤病情的治療。因此，防控家畜布魯氏菌病的發(fā)生也有利于減少人感染布魯氏菌病的概率。

延伸因子(elongation factors，EF)是在mRNA翻譯時(shí)促進(jìn)多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子，在原核生物和真核生物中延伸的因子并不相同。原核延伸因子是原核細(xì)胞進(jìn)行翻譯時(shí)所需要的3種延伸因子，分別命名為EF-Tu、EF-Ts以及EF-G(其中EF-Tu和EF-Ts可以復(fù)合為EF-T)[15]，原核延伸因子的化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)。布氏桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，可在專業(yè)或非專業(yè)吞噬細(xì)胞內(nèi)增殖。布氏桿菌在宿主細(xì)胞中的存活能力和繁殖能力對(duì)其毒力都是至關(guān)重要的，而加強(qiáng)病原菌與宿主相互作用分子機(jī)制的研究，是預(yù)防和控制布魯氏菌感染的前提。最近研究表明，細(xì)菌EF-Tu蛋白是一種多功能蛋白，不僅僅是作為蛋白翻譯因子起作用，而且更重要的是EF-Tu參與許多重要的細(xì)胞和疾病過程[16]。布氏桿菌EF-Tu在感染宿主細(xì)胞中作用的研究目前依然是空白。關(guān)于布魯氏菌翻譯延伸因子Tu的研究，僅見布魯氏菌BMEI0742基因編碼的翻譯延伸因子Tu。本研究選取羊布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0742基因?yàn)檠芯繉?duì)象，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，檢測(cè)其反應(yīng)原性，分析其生物學(xué)功能，為探討其在布氏桿菌侵入及胞內(nèi)存活過程中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 羊種布魯氏菌16M株、大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、pET-28a載體菌株由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購(gòu)自Promega公司。

1.1.2 試劑 羊種布魯氏菌陽(yáng)性血清由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；誘導(dǎo)劑IPTG購(gòu)自Merck公司；限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ/XhoⅠ)、DNA Marker、T4連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；2×EsTaqMasterMix、細(xì)菌質(zhì)粒小提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限責(zé)任公司；HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG、蛋白Marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限責(zé)任公司；2%蛋白質(zhì)印跡(WB)無蛋白封閉液購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用分析純度的產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)；PCR儀(Eppendorf，nexus GSX1)；低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB，5L/S)；超速離心機(jī)(Thermo，PIC021)；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)；恒溫振蕩器(CRYSTAL，IS-RSV1)；高速冷凍離心機(jī)(ThermoFisher)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY，88-IIN)；水浴鍋(XMTD-8222)；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(DYY-8B)；半干式電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD)；蛋白純化儀(AKTA)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中登錄的布魯氏菌(NC-003317)BMEI0742基因序列設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

以羊種布魯氏菌16M株的滅活菌液(85 ℃金屬浴滅活 1 h)為模板，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(20 μL)見表2，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 10 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 1 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物 4 ℃ 保存或直接進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳?；厥漳康幕蚱?，并將回收后目的片段與pMD19-T載體在16 ℃水浴條件下進(jìn)行連接，連接體系(10 μL)見表3，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-BMEI0742。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行陽(yáng)性篩選，進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，并將提取的質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 連接體系

1.2.2 構(gòu)建BMEI0742基因原核表達(dá)載體 將送公司測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD19-T-BMEI0742和pET-28a載體用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ 進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段和酶切后的線性pET-28a載體。將目的片段和線性pET-28a載體在T4連接酶的作用下16 ℃水浴連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證和酶切鑒定。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化 將篩選出的陽(yáng)性克隆菌在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)過夜的菌液按1 ∶100的比例接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)約1 h，使其D600 nm值為 0.4～0.6，在其他條件不變的情況下，按照不同的誘導(dǎo)劑(IPTG)濃度(終濃度為0.2、0.6、1.0 mmol/L)誘導(dǎo)不同時(shí)間(0、4、6、8 h)后收集菌體。取1 mL菌液離心后，棄掉上清，并在離心管中按照1 ∶4的比例加入經(jīng)過稀釋的1×SDS蛋白上樣緩沖液，在振蕩器上振蕩使菌體和蛋白上樣液充分混勻，在金屬加熱器上100 ℃加熱10 min，取20 μL樣品進(jìn)行15%蛋白電泳，觀察電泳結(jié)果。篩選目的基因的最佳表達(dá)條件，并以最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.4 重組蛋白的Western-Blot檢測(cè) 篩選出最佳表達(dá)條件后，以最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并對(duì)該蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜50 min。將膜放入預(yù)先用TBST緩沖液洗滌后的雜交瓶中，37 ℃封閉90 min，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次7 min。加入1 ∶500比例稀釋的、經(jīng)石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定的羊種布魯氏菌陽(yáng)性血清，37 ℃孵育2 h，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次7 min，然后加入 1 ∶5 000 比例稀釋的辣根過氧化氫酶標(biāo)記的兔抗綿羊IgG，37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次7 min。避光條件下，DAB顯色劑顯色后拍照。

1.3 重組蛋白的生物信息學(xué)分析

1.3.1 跨膜結(jié)構(gòu)分析 通過TMHMM Server v.2.0在線軟件分析(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.3.2 信號(hào)肽分析 利用SignalP 4.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的信號(hào)肽。

1.3.3 抗原決定簇的預(yù)測(cè) 利用Predicting Antigenic Peptides在線軟件預(yù)測(cè)(http：//imed.med.uce.es/Tools/antigenic.pl)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的抗原決定簇。

1.3.4 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過SOPMA在線軟件分析(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl?page=/NPSA/npsa-sopma.html)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.5 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過Phyre2在線服務(wù)器預(yù)測(cè)(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.6 蛋白的3D模型評(píng)估 利用PDBsum Generate在線評(píng)估(http：//www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)羊種布魯氏菌的BMEI0742蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及酶切鑒定

NCBI上羊種布魯氏菌的BMEI0742基因的片段大小為 1 221 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與實(shí)際大小一致，結(jié)果如圖1所示。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ/XhoⅠ)進(jìn)行雙酶切后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，得到大小與預(yù)期結(jié)果相符的基因條帶，表明羊種布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0742基因已經(jīng)成功插入 pET-28a 表達(dá)載體中(圖2)。

2.2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

為尋找重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度，分別在誘導(dǎo)劑濃度不變的前提下，設(shè)置時(shí)間梯度篩選最佳誘導(dǎo)時(shí)間；在誘導(dǎo)時(shí)間不變的前提下，設(shè)置誘導(dǎo)劑濃度梯度篩選最佳誘導(dǎo)劑濃度，進(jìn)而篩選出最佳的誘導(dǎo)條件。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)8 h時(shí)重組蛋白表達(dá)量最高，結(jié)果如圖3所示。蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化，SDS-PAGE分析表明，純化后的蛋白條帶清晰，無雜帶，表明純化效果較好(圖4)。

2.3 Western-Blot檢測(cè)

對(duì)誘導(dǎo)8 h后的重組蛋白純化后進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)，200 mA恒流電流下轉(zhuǎn)膜50 min，經(jīng)觀察，可見明顯的陽(yáng)性條帶，說明誘導(dǎo)得到的重組蛋白能被HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG抗體識(shí)別，且大小與pET-28分子質(zhì)量加上目標(biāo)分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符，結(jié)果如圖5所示。

2.4 目的蛋白的生物信息學(xué)分析

通過TMHMM Server v.2.0在線軟件分析得出，BMEI0742蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(圖6)。通過SignalP 4.1 Server在線預(yù)測(cè)得出，BMEI0742蛋白沒有信號(hào)肽(圖7)。經(jīng)Predicting Antigenic Peptides在線軟件得出，BMEI0742蛋白有18個(gè)抗原決定簇(圖8)。

經(jīng)SOPMA在線軟件分析得出，BMEI0742蛋白中有127個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋，占所有氨基酸的32.48%；99個(gè)氨基酸參與延伸鏈的形成，占所有氨基酸的25.32%；45個(gè)氨基酸參與β-折疊的形成，占所有氨基酸的11.51%；另外，還有120個(gè)氨基酸參與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的形成，占所有氨基酸的30.69%(圖9)。通過Phyre2在線服務(wù)器分析預(yù)測(cè)，BMEI0742蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖10所示。經(jīng)PDBsun Generate在線評(píng)估，在BMEI0742蛋白的3D同源模型的Ramachandran圖中可以看出，375個(gè)氨基酸殘基中有250個(gè)處于核心允許區(qū)，占78.9%；58處于額外允許區(qū)，占 18.3%；7個(gè)處于最大允許區(qū)，占2.2%；同時(shí)，也存在0.6%的氨基酸位于不允許區(qū)域中，這說明該模型具有一定的可信度，結(jié)果如圖11所示。

3 討論與結(jié)論

布病在全球170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，主要分布于地中海、非洲、拉丁美洲、中東和亞洲的部分地區(qū)[17]。我國(guó)各省(市、區(qū))均有人、畜不同程度的布病流行。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，布病已經(jīng)開始從牧區(qū)轉(zhuǎn)向工業(yè)化或者是人口密集的經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)蔓延。同時(shí)，商務(wù)和休閑旅游等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、人口流動(dòng)的增加促使布病非疫區(qū)新發(fā)病例呈上升態(tài)勢(shì)[18]。

生物信息學(xué)是利用計(jì)算機(jī)作為輔助工具，對(duì)生物信息數(shù)據(jù)進(jìn)行整理歸納，探索生物奧秘的科學(xué)，它主要體現(xiàn)在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)兩大領(lǐng)域。布魯氏菌基因組的測(cè)序與分析為揭示布魯氏菌生存機(jī)制、分類與進(jìn)化、毒力演化、疫苗株的弱化機(jī)制等提供有力支持，為闡述布魯氏菌毒力相關(guān)基因的演化歷史提供依據(jù)。自2002年羊種布魯氏菌16M參考基因組測(cè)序完成以來，已經(jīng)有300多株布魯氏菌基因組完成了測(cè)序，其中有16株基因組已經(jīng)完成了精細(xì)物理圖譜的繪制[19]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，羊種布魯氏菌和牛種布魯氏菌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究都有不少報(bào)道，包括全菌蛋白質(zhì)組學(xué)[20]、膜蛋白質(zhì)組學(xué)[21-22]、免疫蛋白質(zhì)組學(xué)[23-24]、分泌蛋白質(zhì)組[3]等都有研究。本研究對(duì)BMEI0742蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，有助于了解蛋白質(zhì)的功能，為布魯氏菌的致病機(jī)制研究作基礎(chǔ)。

細(xì)菌EF-Tu是翻譯過程中重要的蛋白因子，也是含量最多的蛋白之一，在原核生物中廣泛存在[25]，且高度保守，被廣泛用來進(jìn)行種系發(fā)生分析[26]。最近的研究表明，EF-Tu是一種重要的多功能蛋白，不僅僅是作為蛋白翻譯因子起作用，而且更重要的是EF-Tu參與許多重要的細(xì)胞和疾病過程，包括信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯控制、凋亡、細(xì)胞骨架組成等。EF-Tu 沒有信號(hào)膚卻能聯(lián)合其他一些缺乏分泌信號(hào)的蛋白以類似外吐小體(exosome)的運(yùn)輸方式分泌并干擾宿主細(xì)胞信號(hào)傳遞[27]。EF-Tu蛋白自身也具有較強(qiáng)的免疫原性，在細(xì)菌中高度保守，且該蛋白在其他多個(gè)種屬細(xì)菌中已有關(guān)于作為鑒別診斷和候選亞單位疫苗的潛力的報(bào)道[28]。在綿羊布氏桿菌疫苗株M5-90致弱分子機(jī)制的研究過程中發(fā)現(xiàn)，EF-Tu具有很強(qiáng)的免疫原性，而重組的EF-Tu蛋白免疫小鼠后可以部分抵抗強(qiáng)毒株羊種布魯氏菌M28的攻擊[29]。顯然，EF-Tu在多種細(xì)菌中均具有誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的能力。這說明EF-Tu蛋白在細(xì)菌感染宿主的過程中，作為一種重要的免疫原被宿主細(xì)胞所識(shí)別和捕獲，可能在其致病過程中發(fā)揮重要作用。

經(jīng)過BMEI0742蛋白的生物信息學(xué)分析顯示，BMEI0742蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，不能進(jìn)行胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)。BMEI0742蛋白沒有信號(hào)肽，說明BMEI0742蛋白屬于非分泌型蛋白。BMEI0742蛋白擁有一定數(shù)量的抗原表位，表明BMEI0742蛋白作為抗原能引起良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。BMEI0742蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是以α-螺旋為主，都是通過骨架上的羥基和酰胺集團(tuán)之間形成的氫鍵維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。本研究成功構(gòu)建了BMEI0742蛋白的三維模型，該模型具有一定的可信度，有利于蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的可視化分析，具體的生物學(xué)功能需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

總之，布魯氏菌的病原與宿主的相互作用是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。本研究通過構(gòu)建布魯氏菌BMEI0742基因的原核表達(dá)載體并對(duì)其反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定以及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究EF-Tu在布魯氏菌感染宿主細(xì)胞過程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能提供依據(jù)。