隱丹參酮聯(lián)合順鉑抗非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞JAK2/STAT3機(jī)制研究

雷俊華 許冠華 曾江正 黃 芬 何志惠 盧彥達(dá)

順鉑是周期非特異性抗腫瘤藥物，適用于多種惡性腫瘤的化療，長期以來作為一線化療藥物應(yīng)用于臨床，但其毒副作用和多次使用后出現(xiàn)的耐藥性限制了其在臨床的應(yīng)用。采用中藥聯(lián)合化療是中國治療腫瘤的獨特治療模式，眾多研究表明隱丹參酮具有抗腫瘤活性，聯(lián)合放化療可以起到增效減毒的作用[1-2]。但其聯(lián)合抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚。本文以非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞為研究對象，探討隱丹參酮聯(lián)合順鉑在非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞中的作用及其機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

隱丹參酮、順鉑、非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞、CCK-8試劑盒、多克隆兔一抗Bcl-2、Survivin、STAT3、JAK2、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9；多功能全波長酶標(biāo)儀、蛋白印跡檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、凝膠成像系統(tǒng)、激光共聚焦顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞培養(yǎng) NCI-H1975細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃、90%濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液，待細(xì)胞生長至80%～90%時，用0.1%胰酶消化并傳代，選取對數(shù)生長期的NCI-H1975細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測用藥后NCI-H1975細(xì)胞增殖抑制的作用 取對數(shù)生長期的NCI-H1975細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(4×103個/孔)，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，試驗分為4組：(1)對照組，細(xì)胞培養(yǎng)不加藥物；(2)隱丹參酮組，加入濃度為10 μM的隱丹參酮；(3)順鉑組，加入濃度為5 μg/mL的順鉑；(4)隱丹參酮聯(lián)合順鉑組(以下簡稱聯(lián)合用藥組)，加入濃度為10 μM的隱丹參酮和濃度為5 μg/mL的順鉑，各組設(shè)置6個復(fù)孔，待藥物作用12、24、48和72 h后，分別加入CCK-8試劑10 μL/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定490 nm的吸光度(OD)值，實驗重復(fù)3次，按照以下公式計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[(對照組OD值-藥物處理組OD值)/對照組OD值]×100%，實驗重復(fù)3次[3]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)定量隱丹參酮聯(lián)合順鉑對NCI-H1975細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的NCI-H1975細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2×105個/孔)，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞完全貼壁，藥物作用24 h后收集各組細(xì)胞，用冷PBS洗細(xì)胞兩次，離心1 000 r/min 5 min，加入500 μL的Binding Buffer重懸后加入 5μL AnnexinV FITC和5 μL PI混勻后，室溫下避光反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測藥物作用于NCI-H1975細(xì)胞后凋亡蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的NCI-H1975細(xì)胞，藥物作用24 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上放置30 min，每10 min振蕩一次，離心12 000 rpm/min 5 min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置，-30℃貯存?zhèn)溆?。灌?0% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，ECL顯色。檢測Bcl-2、Survivin、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)水平，STAT3及JAK2蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平，β-Actin作為內(nèi)參，Quantity one軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度值檢測。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 NCI-H1975細(xì)胞STAT3細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄活性的檢測 藥物作用于細(xì)胞24 h后，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min、0.1%X-Triton細(xì)胞膜通透10 min、5%BSA封閉1 h，一抗兔STAT3磷酸化Tyr705(1∶100稀釋)室溫避光孵育2 h。PBS洗滌三次，羅丹明標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶100)孵育2 h。PBS洗滌3次，DAPI染核5 min后封片。激光共聚焦檢測STAT3在胞漿和胞核定位情況。

將STAT3熒光素酶報告基因載體和海腎熒光素酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1975，藥物作用24 h，加入裂解液裂解30 min，離心取上清，熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，海腎熒光素酶的活性作內(nèi)參。每組樣本檢測3復(fù)孔，取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮聯(lián)合順鉑對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞增殖的影響

隨著時間的延長，單藥組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率均低于對照組(P<0.05)，與對照組及單藥組相比，聯(lián)合用藥組在各時間點均明顯抑制NCI-H1975細(xì)胞增殖活性(P<0.05)(圖1)。

2.2 藥物作用于NCI-H1975細(xì)胞24 h后的細(xì)胞存活情況

順鉑組的細(xì)胞存活率為(70.70±2.04)%，隱丹參酮組細(xì)胞存活率為(77.80±3.25)%，聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率為(47.77±5.06)%，順鉑組、隱丹參酮組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率均低于對照組(P<0.05)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率顯著低于單藥組(P<0.05)(圖2)。

2.3 藥物作用于NCI-H1975細(xì)胞后相關(guān)蛋白變化

與對照組和單藥組對比，聯(lián)合用藥組作用于NCI-H1975細(xì)胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin表達(dá)水平下降，Cleaved-caspase 3和Cleaved-aspase 9蛋白表達(dá)增加(P<0.01)(表1，圖3)。

圖1 CCK-8法隱丹參酮聯(lián)合順鉑對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞增殖的影響Figure 1 The effect of cryptotanshinone combined with cisplatin on the proliferation of non small cell lung cancer NCI-H1975 cells was detected by CCK-8 assay Note：*P<0.05，compared with the control group；#P<0.05，compared with the single drug groups.

圖2 FCM法檢測藥物作用于NCI-H1975細(xì)胞的后的細(xì)胞存活情況Figure 2 The survival rates of NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination were detected by FCM assay

GroupBcl-2/β-ActinSurvivin/β-ActinCle-caspase3/β-ActinCle-caspase9/β-Actinp-JAK/β-Actinp-STAT3/β-ActinCtrl1.15±0.070.92±0.030.06±0.020.07±0.011.52±0.031.43±0.09CPT0.91±0.04*0.84±0.04*0.26±0.03*0.29±0.01*1.05±0.08*1.12±0.03*DDP0.74±0.04*0.69±0.04*0.46±0.04*0.48±0.04*0.81±0.03*0.84±0.07*DDP+CPT0.48±0.03*#0.51±0.02*#0.79±0.05*#0.64±0.05*#0.34±0.07*#0.42±0.08*#

Note：*P<0.01，compared with the control group；#P<0.01，compared with the single drug groups.

Western blot法進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組及單藥組相比，聯(lián)合用藥組信號通路中JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但其磷酸化表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)(圖4)。

2.4 隱丹參酮聯(lián)合順鉑對NCI-H1975細(xì)胞STAT3轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄活性的影響

聯(lián)合用藥組作用于NCI-H1975細(xì)胞，激光共聚焦顯示細(xì)胞核內(nèi)的亮度明顯降低，提示核內(nèi)STAT3明顯減少；熒光素酶進(jìn)一步檢測藥物作用于細(xì)胞后，提示聯(lián)合用藥后核內(nèi)的STAT3活性降低明顯，與對照組及單藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5，6)。

圖3 藥物作用于NCI-H1975細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白及抗凋亡蛋白表達(dá)情況Figure 3 The expression of cleaved caspase-3，9，Bcl-2，Survivin and β-Actin protein in NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination

圖4 免疫印跡技術(shù)檢測藥物作用于NCI-H1975細(xì)胞后STAT3及其磷酸化水平的表達(dá)Figure 4 The expression level of STAT3 protein in NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination

圖5 激光共聚焦檢測隱丹參酮聯(lián)合順鉑對NCI-H1975細(xì)胞STAT3轉(zhuǎn)錄情況Figure 5 The translocation of STAT3 in the nucleus of NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination

圖6 熒光素酶檢測隱丹參酮聯(lián)合順鉑對NCI-H1975細(xì)胞STAT3轉(zhuǎn)錄活性的影響Figure 6 The transcriptional activity of STAT3 in NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combinationNote：*P<0.05，vs. Ctrl group；#P<0.05，vs. single drug group.

3 討論

肺癌發(fā)病率及死亡率居惡性腫瘤首位，發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，大多數(shù)患者確診時，病情已為中晚期，錯過了手術(shù)治療時機(jī)。臨床上中晚期肺癌以鉑類為主的兩藥聯(lián)合方案化療為主要治療手段之一[4]。順鉑作為主要鉑類用藥，其在肺癌中的有效性得到了廣泛的驗證，但其大劑量使用所產(chǎn)生的副作用也一直困擾著臨床醫(yī)生。尋找一種藥物可協(xié)同順鉑抗腫瘤，從而降低順鉑使用劑量是解決該困惑的主要手段之一。

隱丹參酮是從丹參中提取的一種成分，與細(xì)胞毒性的化療藥相比較，其對人體的毒副作用少，并具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，已被證實對肺癌有抑制生長的作用[5]。但與順鉑聯(lián)合應(yīng)用是否可協(xié)同抗腫瘤作用及其作用機(jī)制鮮少見報道。

本課題的目的是研究隱丹參酮聯(lián)合順鉑具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)及其可能的機(jī)制，該研究結(jié)果提示隨著時間的延長，隱丹參酮、順鉑組及聯(lián)合用藥組肺癌細(xì)胞存活率均低于對照組。與對照組及單藥組相比，聯(lián)合用藥組在各時間點均明顯抑制NCI-H1975細(xì)胞增殖活性，結(jié)果提示順鉑、隱丹參酮對肺癌細(xì)胞均有抑制作用，兩藥聯(lián)合作用于NCI-H1975細(xì)胞，抑制作用進(jìn)一步加強，提示隱丹參酮聯(lián)合順鉑抗腫瘤效果增加。

細(xì)胞凋亡受阻和過度增殖是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，在細(xì)胞凋亡過程中，Caspase家族和Bcl-2基因家族發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Caspase3和Caspase9是Caspase家族中重要成員[6]，Caspase9是內(nèi)源性凋亡途徑中的一個中間執(zhí)行者，Caspase9接受細(xì)胞色素C誘導(dǎo)的死亡信號，進(jìn)一步激活下游執(zhí)行型Caspase3，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2可直接與凋亡刺激因子結(jié)合抑制Caspase3的激活，從而表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的作用[7]。正常情況下，Caspase3和Caspase9為無活性的蛋白酶原，受細(xì)胞內(nèi)外信號刺激后，剪切為Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9后被激活。survivin蛋白可能通過Caspase家族抑制凋亡或可能通過抑制細(xì)胞色素C的釋放在線粒體水平參與抗凋亡[8]。那么隱丹參酮聯(lián)合順鉑作用于非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞是否也能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表達(dá)，激活Caspase 3和Caspase 9活性，而起到抗凋亡的作用呢？本研究結(jié)果顯示，隱丹參酮聯(lián)合順鉑作用于NCI-H1975細(xì)胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2，Survivin表達(dá)水平明顯下降，Caspase 3和Caspase 9活性明顯提高。說明兩藥聯(lián)合抗腫瘤的機(jī)制可能與下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2及Survivin有關(guān)。

JAK蛋白家族是一類非受體型酪氨酸激酶，分4個亞型，STAT家族是其下游信號蛋白，JAK2和STAT3作為JAK/STAT信號通路的重要成員，主要參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程[9]。在正常組織中JAK2/STAT3信號通路受到嚴(yán)密的調(diào)控，STAT處于失活狀態(tài)，而在腫瘤細(xì)胞中被異常激活而高表達(dá)[10-11]。而且該信號通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用，抑制該通路可明顯降低肺癌細(xì)胞的增殖[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮聯(lián)合順鉑作用于非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞后，STAT3及JAK2蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但其磷酸化表達(dá)水平下降。進(jìn)一步應(yīng)用激光共聚焦顯示細(xì)胞核內(nèi)的亮度明顯降低，提示核內(nèi)STAT3明顯減少；熒光素酶顯示隱丹參酮聯(lián)合順鉑作用后核內(nèi)的STAT3活性降低，說明隱丹參酮聯(lián)合順鉑可抑制信號通路中JAK2和STAT3磷酸化水平，提示抑制JAK2/STAT3信號通路的磷酸化，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，隱丹參酮和順鉑單獨和聯(lián)合作用處理非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞株，與單一藥物作用相比，聯(lián)合用藥對肺癌細(xì)胞有更明顯的抑制作用。此結(jié)果為隱丹參酮作為順鉑的化學(xué)敏化劑提供理論依據(jù)。其機(jī)制與抑制信號通路JAK2/STAT3磷酸化，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)，提高Caspase 3和Caspase 9活性有關(guān)?；陔[丹參酮對順鉑治療肺癌患者具有化療增敏性，故有望成為肺癌患者治療的重要輔助用藥。