基于PI3K/Akt信號(hào)通路的漢黃芩素抗骨肉瘤作用機(jī)制研究

段大鵬 劉珊珊 李偉偉 馮 敏 姬 樂(lè) 秦 靜

眾所周知，骨肉瘤又稱(chēng)成骨肉瘤，是青少年兒童最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤，其在早期即可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，死亡率較高[1-3]。然而，人體骨組織密度大、藥物滲透性差，加上其他復(fù)雜的生理生化原因，環(huán)磷酰胺、順鉑、阿霉素等傳統(tǒng)抗腫瘤藥物很難到達(dá)患病部位，因此治療效果不佳[4-6]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素(5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮，Wogonin)具有特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制新生血管形成等作用[7-8]。PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化調(diào)節(jié)，在凋亡調(diào)控中具有重要地位，是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程的重要信號(hào)通路之一。漢黃芩素抗腫瘤作用機(jī)制涉及了多條重要細(xì)胞信號(hào)通路[9-10]，然而其對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路是否有影響尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究基于既往研究，研究漢黃芩素對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其與PI3K/Akt信號(hào)通路之間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

漢黃芩素由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，用PBS溶解后，配制成適合濃度；人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；COX-2、Caspase3及p-Akt抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；雙抗購(gòu)自山東魯抗制藥公司；二甲基亞砜(DMSO)、四氮噻唑鹽(MTT)等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮中儲(chǔ)存的MG-63細(xì)胞取出，放入37℃水浴箱中，溶化后吸出細(xì)胞懸液，注入離心管，棄上清后移至培養(yǎng)瓶。DMEM培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2。在光學(xué)顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞貼壁融合度約為80%時(shí)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MG-63細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63單細(xì)胞懸液按組接種于96孔培養(yǎng)板中，分別加入含0、50、100及200 μmol/L漢黃芩素的培養(yǎng)液。分別于24 h、48 h及72 h后加入20 μL MTT，4 h后加DMSO 10 min。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)每孔吸光度(OD)值，以空白對(duì)照孔OD值調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

MG-63細(xì)胞用0.25%胰酶消化，以105/mL細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。設(shè)0、50、100及200 μmol/L 4個(gè)組別，按組別加入不同濃度漢黃芩素。采用Annexin V/PI雙染色法。胰酶消化后，離心收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。取100 μL細(xì)胞懸液分別加500 μL的1×Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC及10 μL PI，反應(yīng)10 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MG-63細(xì)胞遷移能力

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MG-63細(xì)胞，0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以105/mL細(xì)胞密度接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，按組別加入不同濃度漢黃芩素(0、50、100、200 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%時(shí)吸出培養(yǎng)液，Marker筆在6孔板背面作標(biāo)記，移液器槍頭垂直于標(biāo)記線(xiàn)劃痕，PBS液沖洗3次，去除劃痕處的細(xì)胞；24 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移并拍照。

1.6 透射電鏡檢測(cè)超微結(jié)構(gòu)

MG-63細(xì)胞采用不同濃度漢黃芩素(0、50、100、200 μmol/L)處理后，0.25%胰酶消化，用2.5%戊二醛固定，送西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室觀察并拍照。

1.7 Western blot法檢測(cè)COX-2、Caspase-3及p-Akt蛋白表達(dá)

按組別加入不同濃度漢黃芩素(0、50、100、200 μmol/L)至MG-63細(xì)胞懸液中，提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部結(jié)束電泳，取下凝膠并作標(biāo)記，入電轉(zhuǎn)緩沖液平衡5 min后轉(zhuǎn)膜。纖維素膜一側(cè)靠正極，膠一側(cè)靠負(fù)極。然后抗原抗體反應(yīng)，并用辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)增強(qiáng)劑顯色反應(yīng)。蛋白的表達(dá)水平根據(jù)GAPDH進(jìn)行標(biāo)化，通過(guò)軟件進(jìn)行灰度掃描、定量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響

0、50、100、200 μmol/L組在72 h的細(xì)胞增殖抑制率分別為3.54±0.09%、20.9±2.33%、28.2±4.01%、47.2±8.11%，50、100、200 μmol/L組與0 μmol/L組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 200 μmol/L組細(xì)胞增殖抑制率在24 h、48 h、72 h分別為18.2±3.33%、31.4±5.25%、47.2±8.11， 48 h、72 h時(shí)與24 h相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2 漢黃芩素對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組不同濃度(50、100、200 μmol/L)漢黃芩素處理MG-63細(xì)胞后，其凋亡指數(shù)分別為23.98%、36.47%、55.72%，顯著高于對(duì)照組(0 μmol/L)的11.43%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

表1 MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果

Note：*P<0.05，compared with the negative control；#P<0.05，compared with the 24 h group.

圖1 不同濃度漢黃芩素對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡率的影響Figure 1 Wogonin induced apoptosis in MG-63 cells by flow cytometryNote：A，B，C and D stand for 0，50，100 and 200 μmol/L respectively.* P<0.05，compared with the negative control group.

2.3 漢黃芩素對(duì)MG-63細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示漢黃芩素對(duì)MG-63細(xì)胞遷移能力有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性(圖2)。

圖2 MG-63細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)Figure 2 Wogonin inhibited the ability of migration in MG-63 cells

2.4 漢黃芩素對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下觀察，可見(jiàn)漢黃芩素可改變?nèi)斯侨饬鯩G-63細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞體積變小，核固縮，染色質(zhì)邊集，并可見(jiàn)凋亡小體(圖3)。

2.5 漢黃芩素對(duì)MG-63細(xì)胞COX-2、Caspase-3和p-Akt蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組COX-2和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組Caspase-3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明漢黃芩素可抑制COX-2、p-Akt蛋白的表達(dá)，提高Caspase-3在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)水平(圖4)。

圖3 透射電鏡下MG-63細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變(×6000)Figure 3 Ultrastructural changes of MG-63 cells treated with Wogonin

圖4 不同濃度漢黃芩素對(duì)MG-63細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Figure 4 The expression of COX-2，p-Akt and Caspase-3 protein in MG-63 cells treated with wogonin

3 討論

骨肉瘤是常見(jiàn)的原發(fā)性間葉組織腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率逐年增高[11-12]。骨肉瘤好發(fā)于血運(yùn)豐富的長(zhǎng)骨干骺端，惡性程度高，侵襲性和轉(zhuǎn)移性很強(qiáng)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生早，預(yù)后較差，死亡率高，嚴(yán)重危害青少年兒童的健康和生命[13-15]。Ma等[16]認(rèn)為，盡管近年來(lái)以手術(shù)為主的綜合治療方法取得了很大進(jìn)展，能暫時(shí)控制部分患者病情，但患者的5年存活率仍很低。由于骨組織密度高，滲透性差，大多數(shù)傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物很難進(jìn)入患病部位，因此研發(fā)新的抗腫瘤藥物十分迫切。

黃芩是祖國(guó)傳統(tǒng)中藥，為唇形科黃芩屬，產(chǎn)于遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅等地，俄羅斯東西伯利亞、蒙古、朝鮮、日本也有分布。漢黃芩素是從傳統(tǒng)中藥黃芩及半枝蓮中分離提取的一種黃酮類(lèi)化合物。Ge[17]及Wu等[18]試驗(yàn)研究表明，漢黃芩素具有抗腫瘤作用，可抑制腫瘤的生長(zhǎng)，特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制新生血管形成等作用。漢黃芩素具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)分別用0、50、100、200 μmol/L濃度漢黃芩素作用于MG-63細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，漢黃芩素可使細(xì)胞增殖受到抑制，其細(xì)胞增殖抑制率隨著濃度的提高而升高，并且與時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明漢黃芩素不僅可以抑制人骨肉瘤增殖，并且具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

細(xì)胞凋亡受到各種凋亡調(diào)控蛋白的調(diào)控，Caspase蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵分子群，其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行的重要效應(yīng)分子。本研究流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，各組不同濃度漢黃芩素處理MG-63細(xì)胞后，其凋亡指數(shù)分別為23.98%、36.47%、55.72%，顯著高于對(duì)照組。Western blot結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組Caspase-3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明漢黃芩素可提高Caspase-3在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)水平，進(jìn)一步誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致[19]。

PI3K為一個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基組成的異源二聚體蛋白，其調(diào)節(jié)亞基含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域[20]。Liu等研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子均對(duì)PI3K具有激活作用[21-22]。Lim則證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化調(diào)節(jié)，在凋亡調(diào)控中具有重要地位[23]。Rahmani及Chen的研究均證明PI3K/Akt信號(hào)通路是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程的重要信號(hào)通路之一[24]，在許多腫瘤治療中，PI3K/Akt信號(hào)通路活化成為抗腫瘤藥物耐藥的關(guān)鍵點(diǎn)[25]。本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)漢黃芩素抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡作用同時(shí)，對(duì)其機(jī)制作了進(jìn)一步探討。本研究通過(guò)用不同濃度的漢黃芩素作用人骨肉瘤MG-63細(xì)胞，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低，表明漢黃芩素可抑制p-Akt蛋白在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，漢黃芩素通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，深入開(kāi)展?jié)h黃芩素抗癌作用的研究將為骨肉瘤的治療帶來(lái)新的思路。