巖藻糖介導(dǎo)微生物與腸道上皮細(xì)胞的互作及其機(jī)制

張曉音　趙圣國(guó)　駱超超　鄭　楠　王加啟

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

胃腸道是機(jī)體內(nèi)一種獨(dú)特的器官，棲息著大量的致病性和非致病性的微生物。作為機(jī)體中最穩(wěn)定、最密集和最多樣化的菌群[1]，腸道中的微生物參與宿主的各種生理代謝活動(dòng)，對(duì)于宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝、免疫穩(wěn)態(tài)和健康均起著關(guān)鍵作用。人類腸道微生物數(shù)量約有4×1014個(gè)，幾乎和成年人體細(xì)胞數(shù)一樣多[2]。菌群的失調(diào)與許多疾病有關(guān)，如炎癥性疾病[3]、肥胖癥[4]、糖尿病[5]、帕金森病[6]及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]等。宿主在促進(jìn)其與微生物的互作關(guān)系中至關(guān)重要，如黏液層、微生物營(yíng)養(yǎng)來源和免疫細(xì)胞的細(xì)菌識(shí)別等[8]。腸道上皮細(xì)胞是機(jī)體抵抗外界復(fù)雜環(huán)境的第一道防線，其杯狀細(xì)胞分泌產(chǎn)生的黏液層，維持了腸上皮的完整性，對(duì)腸道有潤(rùn)滑、保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用。其中，黏液層黏蛋白側(cè)鏈上的巖藻糖，是一種重要的蛋白糖基化形式，參與了腸道微生物的黏附和定植等，在調(diào)控腸道微生物穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。因此，揭示巖藻糖在腸道微生物與腸道上皮細(xì)胞互作中的調(diào)控作用，對(duì)于促進(jìn)腸道微生物和宿主間的動(dòng)態(tài)平衡，維持腸道健康有重要意義。

1　腸道黏蛋白的巖藻糖糖基化形式與過程

腸道上皮杯狀細(xì)胞通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)和NOD樣受體蛋白6途徑分泌黏蛋白至腸腔[9]，形成具有2層結(jié)構(gòu)的黏液層，即內(nèi)層和外層。黏液內(nèi)層與腸道上皮細(xì)胞緊密連接；黏液外層含有腸道上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌的多糖，為腸道微生物提供豐富的營(yíng)養(yǎng)來源，對(duì)于腸道微生物有一定的選擇和調(diào)控作用[10]。黏蛋白是一種高度糖基化的糖蛋白，其富含絲氨酸、蘇氨酸的蛋白骨架與多種O-型寡聚糖側(cè)鏈結(jié)合，如巖藻糖。在結(jié)腸黏液外層中，O-型寡聚糖側(cè)鏈可以為共生菌提供特異性結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)其定植，抑制致病菌的生長(zhǎng)[11]。Fu等[12]研究表明，O-型寡聚糖側(cè)鏈的缺失或縮短，會(huì)增加細(xì)菌的入侵，誘發(fā)腸道內(nèi)炎癥。黏蛋白上的多糖是共生菌重要的營(yíng)養(yǎng)來源和黏附位點(diǎn)，也是致病菌的首要靶點(diǎn)，其獨(dú)特的生理和免疫功能具有組織差異性。黏蛋白糖基化的水平在一定程度上決定了腸黏膜的屏障功能水平，微生物刺激以及腸道免疫系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的糖基化，進(jìn)而提高微生物在腸腔中的適應(yīng)與生存能力。

黏蛋白的巖藻糖基化是糖基化的重要形式。巖藻糖是黏蛋白側(cè)鏈上重要的糖基，占糖基總數(shù)的4%～14%，它是一種廣泛存在于動(dòng)物腸道中的L-巖藻糖，是腸道微生物重要的能源物質(zhì)。相比于一般的六碳糖，巖藻糖在第6個(gè)碳原子上少1個(gè)羥基，親水性弱，疏水性強(qiáng)，可以作為血型標(biāo)記。在巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase，F(xiàn)ut)的催化下，巖藻糖可與黏蛋白絲氨酸、蘇氨酸殘基羥基相連，以末端修飾的方式使黏蛋白糖基化。目前，在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種Fut基因[13]，其中Fut1和Fut2主要存在于人類和鼠類的小腸，特別是腸道上皮細(xì)胞。Fut2基因是一種分泌型基因，能夠以GDP-巖藻糖的形式轉(zhuǎn)運(yùn)巖藻糖，而GDP-巖藻糖是巖藻糖基化的唯一供體。

在哺乳動(dòng)物中，一般可以通過從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑2種方式合成GDP-巖藻糖，但主要以從頭合成途徑為主[14]。目前發(fā)現(xiàn)的參與合成GDP-巖藻糖的物質(zhì)有3種：胞外的巖藻糖，溶酶體內(nèi)的巖藻糖殘基以及GDP-甘露糖[15]。GDP-甘露糖主要參與從頭合成途徑，在GDP-甘露糖-4,6-脫水酶和GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3,5異構(gòu)酶-4-還原酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為GDP-巖藻糖。被合成后的GDP-巖藻糖發(fā)生異構(gòu)化，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在Fut的介導(dǎo)下進(jìn)行末端修飾。被修飾后的巖藻糖經(jīng)Fut轉(zhuǎn)運(yùn)至腸道上皮細(xì)胞膜的蛋白或脂質(zhì)上，完成巖藻糖基化過程。其中，α1,2-巖藻糖能夠被Fut2特異性調(diào)控，其糖基化修飾主要發(fā)生在杯狀細(xì)胞的細(xì)胞表面，然后分泌至腸腔發(fā)揮糖基化抗原的功能，這種特殊的表達(dá)方式在腸道微生物，特別是共生菌與腸道上皮細(xì)胞的互作中非常重要。如共生菌多形擬桿菌通過產(chǎn)生巖藻糖苷酶分解α1,2-巖藻糖，然后合成這些巖藻糖殘基，并在相關(guān)酶的作用下，循環(huán)利用巖藻糖殘基作為細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分來促進(jìn)自身的定植[16]。

圖1　巖藻糖基化過程

2　微生物調(diào)控腸道上皮細(xì)胞巖藻糖基化過程

腸道微生物誘導(dǎo)巖藻糖基化一般有2種方式，共生菌非依賴模式和共生菌依賴模式。在共生菌非依賴模式中，3型天然淋巴細(xì)胞(type 3 innate lymphoid cell，ILC3)分泌的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)α1β2可不通過共生菌的誘導(dǎo)，直接參與Fut2對(duì)巖藻糖的調(diào)節(jié)。在共生菌依賴模式中，多形擬桿菌已經(jīng)被證明可以誘導(dǎo)人和小鼠的腸道上皮細(xì)胞的巖藻糖基化[16]。Goto等[18]研究表明，分節(jié)絲狀菌(segmented filamentous bacteria，SFB)也可以誘導(dǎo)巖藻糖的表達(dá)，它主要通過共生菌依賴模式激活I(lǐng)LC3，誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞Fut2和巖藻糖的表達(dá)，進(jìn)而抵抗沙門氏菌的感染。巖藻糖，特別是α1,2-巖藻糖的表達(dá)主要在回腸，僅僅少數(shù)α1,2-巖藻糖的表達(dá)在十二指腸和空腸。致病菌，如鼠類檸檬酸桿菌，可以在盲腸而非小腸誘導(dǎo)α1,2-巖藻糖基化[19]。微生物誘導(dǎo)巖藻糖基化的位置不同，可能與其自身在腸道內(nèi)的生態(tài)位分布有關(guān)。對(duì)于無菌小鼠，巖藻糖基化一般發(fā)生在盲腸、結(jié)腸和小腸回腸，但當(dāng)其被植入菌群后，巖藻糖基化發(fā)生在整個(gè)小腸[20]。

一些微生物的代謝產(chǎn)物，也參與誘導(dǎo)腸上皮Fut2和巖藻糖的表達(dá)[21]。斷奶后的幼年大鼠，腸道中多胺和巖藻糖的濃度會(huì)增加，當(dāng)給大鼠飼喂多胺后，發(fā)現(xiàn)腸道巖藻糖基化水平升高[22]。Wlodarska等[23]研究表明，消化鏈球菌屬細(xì)菌能夠利用黏蛋白作為能量來源，裂解并轉(zhuǎn)運(yùn)巖藻糖，促進(jìn)自身的定植，其色氨酸代謝產(chǎn)物吲哚丙烯酸能夠增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞的屏障功能，減輕炎癥反應(yīng)，消化鏈球菌屬和腸道上皮細(xì)胞之間的互作關(guān)系營(yíng)造了良好的腸道環(huán)境。

3　巖藻糖對(duì)腸道微生物的調(diào)控作用

3.1　對(duì)腸道微生物的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用

巖藻糖的本質(zhì)是碳水化合物，可以作為微生物的碳源，調(diào)控腸道微生物與腸道上皮的共生關(guān)系，這個(gè)過程需要巖藻糖苷酶的催化。含有巖藻糖苷酶的微生物可以直接降解宿主或者外源的巖藻糖，也可以將降解的巖藻糖殘基提供給其他不含巖藻糖苷酶的菌群利用。多形擬桿菌通過巖藻糖操縱子，可以上調(diào)與巖藻糖相關(guān)的分解或代謝基因來降解利用巖藻糖，在腸道環(huán)境改變時(shí)將其作為碳源，同時(shí)，還可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的巖藻糖基化[21,24]。脆弱擬桿菌參與腸道內(nèi)的糖代謝過程，利用巖藻糖促進(jìn)自身定植，進(jìn)而更好地適應(yīng)腸道環(huán)境[25]。巖藻糖是空腸彎曲桿菌唯一可以利用的碳水化合物，它通常情況下只能利用氨基酸或檸檬酸代謝途徑來獲取碳源，但是卻可以利用巖藻糖[26]。

Fut2：巖藻糖轉(zhuǎn)移酶2 fucosyltransferase 2。

下圖同。 The same as below.

圖2巖藻糖介導(dǎo)腸道微生物與腸上皮細(xì)胞的共生關(guān)系

Fig.2Fucose creates a symbiotic environment for intestinal microbiota and epithelial cells[17,26]

3.2　對(duì)腸道致病微生物的屏障作用

作為固有免疫系統(tǒng)的組成部分，黏液層表面的多糖可以抵抗致病性微生物的入侵，特別是巖藻糖，可以作為信號(hào)分子，有效的抑制一些致病菌的感染，這是它維持腸道菌群平衡的一個(gè)重要功能。腸道上皮細(xì)胞Fut2缺失，導(dǎo)致巖藻糖的調(diào)控受阻，當(dāng)小鼠Fut2缺陷時(shí)，會(huì)引起腸道菌群失調(diào)，加劇檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的腸道炎癥[19]和鼠傷寒沙門氏菌的易感性[27]。巖藻糖作為黏蛋白糖基化的側(cè)鏈，可以與沙門氏菌的菌毛結(jié)合，使沙門氏菌黏附在黏蛋白上，阻止其異位感染。Pacheco等[28]研究表明，巖藻糖可以通過刺激出血性大腸桿菌的膜受體磷酸化來抑制其毒力相關(guān)操縱子，進(jìn)而降低其對(duì)宿主的致病性。另外，巖藻糖能夠降低炎癥因子，增加緊密連接蛋白的表達(dá)，并上調(diào)小腸中短鏈脂肪酸受體，進(jìn)而緩解腸道黏膜損傷[29]。

巖藻糖還可以顯著降低致病菌消化鏈球菌屬的豐度，減少腸道抗原載體[30]，更重要的是，它可以提高腸道益生菌的豐度[31]，如在Fut2缺陷的小鼠中，梭菌目中的一些共生菌的數(shù)量會(huì)減少[32]。Rodríguez-Díaz等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大部分致病菌不含有巖藻糖苷酶，不能利用巖藻糖，而一些益生菌含有高活性的巖藻糖苷酶，如雙歧桿菌，可以降解巖藻糖合成自身多糖，益生菌的高豐度表達(dá)可能與巖藻糖苷酶有關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在Fut2缺陷的小鼠中，即巖藻糖表達(dá)受阻的情況下，如擬桿菌屬、毛螺菌科等共生菌的數(shù)量會(huì)增加[32]。

圖3　巖藻糖對(duì)腸道致病微生物的屏障作用

4　免疫細(xì)胞對(duì)腸道上皮細(xì)胞巖藻糖表達(dá)的調(diào)控作用

免疫細(xì)胞包含固有免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞，其中，ILC3是調(diào)控巖藻糖表達(dá)的重要的固有淋巴細(xì)胞，無菌小鼠感染后，小腸快速巖藻糖基化與ILC3的激活密切相關(guān)。脂多糖等感染小鼠后，首先誘導(dǎo)腸道樹突細(xì)胞分泌白介素(interleukin，IL)-23，這個(gè)過程與髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response 88，MyD88)信號(hào)的激活有關(guān)，隨后IL-23誘導(dǎo)ILC3釋放IL-22，IL-22可以上調(diào)Fut2的表達(dá)[20]。IL-22是IL-10家族成員，可以被共生菌和致病菌激活，其相關(guān)受體可以激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)，在腸道上皮發(fā)揮防御和組織修復(fù)功能[33-34]，而IL-22缺陷小鼠很容易發(fā)生腸道炎癥[35]。鑒于IL-22能夠提高巖藻糖基化水平，口服巖藻糖基化多糖可以提高易感小鼠的存活率。ILC3還可以分泌腫瘤壞死因子(TNF)家族成員LTα，但LTα是以共生菌非依賴模式調(diào)控Fut2，進(jìn)而調(diào)控巖藻糖基化的，它的表達(dá)不受抗生素的影響。IL-22和LTα的表達(dá)均依賴ILC3轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt)和分化抑制因子2(inhibitor of differentiation 2，Id2)，但兩者具體發(fā)揮的機(jī)制還不是很清楚。有報(bào)道，LTα的表達(dá)促進(jìn)樹突細(xì)胞IL-23的分泌，隨后調(diào)控了ILC3對(duì)IL-22的表達(dá)[36]，ILC3分泌的IL-22對(duì)LTα的表達(dá)是否有影響還不清楚。

獲得性免疫細(xì)胞也可以調(diào)控巖藻糖基化，但其對(duì)巖藻糖和Fut的表達(dá)呈負(fù)向調(diào)控[37]。重組激活基因(recombination activating gene，Rag)缺陷小鼠不能表達(dá)T細(xì)胞和B細(xì)胞，研究表明，和野生型小鼠相比，Rag缺陷小鼠可以高表達(dá)腸道上皮細(xì)胞的巖藻糖，并且，只有產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞亞群能夠抑制腸道上皮的巖藻糖表達(dá)[18]。在Rag缺陷小鼠的腸上皮中還發(fā)現(xiàn)，ILC3細(xì)胞的數(shù)量和其分泌的IL-22的表達(dá)均升高，這提示T細(xì)胞可以負(fù)向調(diào)控ILC3細(xì)胞的數(shù)量和IL-22的表達(dá)[38]，可能與競(jìng)爭(zhēng)ILC3生態(tài)位或產(chǎn)生某些抑制因子有關(guān)。獲得性免疫細(xì)胞的缺失促進(jìn)腸上皮巖藻糖基化，這可能是一種補(bǔ)償保護(hù)反應(yīng)來促進(jìn)腸腔的自我平衡。腸道免疫系統(tǒng)是腸道上皮巖藻糖基化重要的協(xié)調(diào)者，維持并改善了宿主和腸道微生物的共生環(huán)境。

5　小　結(jié)

巖藻糖作為一種能源和調(diào)控物質(zhì)，可以被腸道微生物利用，并能促進(jìn)共生菌的定植，抵抗致病菌的感染，進(jìn)而更好地維持腸道菌群平衡，其發(fā)揮作用的途徑大致有以下幾種。巖藻糖可能參與某些菌群的代謝途徑，誘導(dǎo)菌群產(chǎn)生一些對(duì)宿主有益的代謝產(chǎn)物，如多種氨基酸、維生素和短鏈脂肪酸等。巖藻糖可能還會(huì)影響某些細(xì)菌相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制糞腸球菌毒性基因的表達(dá)。另外，巖藻糖促進(jìn)了腸道益生菌的定植，如疣微菌科、擬桿菌屬等，進(jìn)而維持腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡。但并不是利用巖藻糖的菌群都是對(duì)宿主有益的，巖藻糖也是一些致病菌的黏附位點(diǎn)，如胃腸腔的幽門螺桿菌，其分泌的黏附素與胃腸道上皮細(xì)胞的巖藻糖結(jié)合，以此為媒介感染宿主[40]。

IL-10：白介素-10 interleukin 10；IL-22：白介素-22 interleukin 22；IL-23：白介素-23 interleukin 23；ILC3:3型天然淋巴細(xì)胞 type 3 innate lymphoid cell；RORγt：維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt retinoic acid-related orphan receptor γt；Id2：分化抑制因子2 inhibitor of differentiation 2；LTα：淋巴毒素α lymphotoxin α；MyD88：髓樣分化因子88 myeloid differentiation primary response 88；LPS：脂多糖 lipopolysaccharide。

圖4免疫細(xì)胞調(diào)控腸道上皮細(xì)胞巖藻糖的表達(dá)

Fig.4Immune cells regulate the expression of the fucose in intestinal epithelial cells[18,20,39]

腸道微生物的代謝產(chǎn)物反過來又可以影響腸道上皮細(xì)胞，促進(jìn)宿主的防御能力，進(jìn)而營(yíng)造良好的腸道環(huán)境，微生物與宿主間的這種互惠互利的共生關(guān)系，提高了機(jī)體抵抗外界感染的能力，對(duì)一些疾病的預(yù)防有積極作用。但是，對(duì)于巖藻糖如何識(shí)別共生菌和致病菌，如何參與不同腸道微生物的代謝途徑，以及腸道不同區(qū)域巖藻糖基化程度為何不同等，還不是很清楚。如果能夠進(jìn)一步深入研究，更加明確巖藻糖調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，對(duì)于維持腸道健康有重要的指導(dǎo)意義。

本文主要對(duì)黏蛋白側(cè)鏈上的巖藻糖及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，外源的巖藻多糖，如墨角藻多糖、褐藻糖膠、褐藻多糖硫酸酯等均含有巖藻糖，在抗凝血、抗血栓、抗病毒以及抗腫瘤[41]方面均有重要作用。外源的巖藻糖能夠被含有巖藻糖苷酶的微生物直接降解，當(dāng)腸道上皮細(xì)胞巖藻糖表達(dá)不足時(shí)，外源添加巖藻糖是否可以促進(jìn)其巖藻糖基化，進(jìn)而更好的維持腸道穩(wěn)態(tài)，這也為人類膳食、動(dòng)物飼養(yǎng)以及飼料添加劑的選擇提供重要參考。