Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的檢測對甲狀腺腺瘤患者及臨床意義

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(長海醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200433)

甲狀腺腺瘤在人群中有很高的發(fā)病比例，隨著目前人群健康體檢的重視，使得甲狀腺腺瘤的檢出率逐年提高。據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明，甲狀腺腺瘤在全球以每年4%發(fā)病率的趨勢增長[1]。目前甲狀腺腺瘤的發(fā)病機制及診斷是研究的熱點。近年來，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路對癌干細胞的影響成為熱點[2-4]。較多研究表明[5-7]，Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展。但有關(guān)Wnt/β-catenin信號通路在甲狀腺腺瘤發(fā)病機制中的研究較少。因此，本研究擬探討甲狀腺腺瘤患者Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1，β-catenin的檢測及臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集我院2016年1月～2017年1月60例甲狀腺腺瘤患者，納入標準：①經(jīng)術(shù)前CT核素掃描、頸部超聲及穿刺組織后病理檢查證實為單發(fā)甲狀腺腺瘤；②所有患者均未經(jīng)任何藥物治療。排除標準：①臨床資料不完整者，伴有其他惡性疾病者；②未獲得患者知情同意者。同時選取我院同期60例健康體檢者作為對照組，且該60例健康體檢者自愿接受免費組織穿刺病理檢查并簽署知情同意書。疾病組60例，男31例，女29例，年齡21～87歲，平均57.7±2.8歲。對照組60例，男30例，女30例，年齡20～85歲，平均57.9±3.0歲。兩組的一般資料有可比性。本研究通過我院倫理委員會審核。

1.2主要儀器和試劑TGL-16G-A型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；7300型實時熒光定量PC電子天平R儀(美國Applied Biosystems公司)；EL204- (上海特勒-托多利多儀器有限公司)。

1.3RT-PCR檢測Wnt-1、β-catenin mRNA表達水平提取組織總RNA，測定RNA純度和濃度，取1μg進行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進行定量檢測，Wnt-1、β-catenin及GAPDH(內(nèi)參)擴增引物序列如下：Wnt-1：上游引物5′-CTGCAGAGCATGGACTCGTC-3′，下游引物5′-CCGTTGAAGAGAGTGGAGTG-3′，β-catenin：上游引物5′-TACTCACGC CTCGAAACCT-3′，下游引物5′-GTC TGCTTTCCTCCCTGATG-3′，GAPDH：上游引物5′-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3，下游引物5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3，擴增條件及計算方法參考文獻[8]。

1.4Western blot檢測Wnt-1、β-catenin蛋白的表達水平常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法測定蛋白質(zhì)含量后，進行凝膠電泳，每孔上樣20 μg，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上后，3%的脫脂奶封閉2 h，分別孵育Wnt-1、β-catenin(目的蛋白)和內(nèi)參蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影[9-10]。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采取SPSS 17.0軟件。對于正態(tài)分布和偏態(tài)分布數(shù)據(jù)資料，分別以均值±標準差和中位數(shù)(P25-P75)表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，偏態(tài)分布兩組間比較則應(yīng)用Mann-Whitney U法。率的比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1RT-PCR檢測Wnt-1、β-catenin mRNA表達水平結(jié)果采用RT-PCR方法檢測兩組研究對象組織中Wnt-1、β-catenin mRNA表達水平，甲狀腺腺瘤組Wnt-1、β-catenin mRNA表達量高于對照組Wnt-1、β-catenin mRNA表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體見表1。

表1　RT-PCR檢測Wnt-1、β-catenin mRNA表達水平結(jié)果　(n=60)

與對照組相比，aP<0.05

2.2Western blot檢測Wnt-1、β-catenin蛋白表達水平結(jié)果采用Western blot方法檢測兩組研究對象組織中Wnt-1、β-catenin 蛋白表達水平，甲狀腺腺瘤組Wnt-1、β-catenin 蛋白表達量高于對照組Wnt-1、β-catenin 蛋白表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體見表2和圖1。

表2　Western blot檢測Wnt-1、β-catenin蛋白表達水平結(jié)果　(n=60)

與對照組相比，aP<0.05

圖1　Wnt-1、β-catenin蛋白的表達

2.3Wnt-1、β-catenin表達與甲狀腺腺瘤患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析

甲狀腺腺瘤患者腫瘤組織Wnt-1陽性率65.00%(39/60)高于對照組Wnt-1陽性率21.67%(13/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。甲狀腺腺瘤患者腫瘤組織β-catenin陽性率61.67%(37/60)高于對照組β-catenin陽性率20.00%(12/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。統(tǒng)計分析證實Wnt-1表達與甲狀腺腺瘤患者腫瘤直徑密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。β-catenin表達也與甲狀腺腺瘤患者腫瘤直徑密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體見表3。

表3　甲狀腺腺瘤患者Wnt-1、β-catenin表達與患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析　(例,%)

與腫瘤直徑(cm)≤4比較，aP<0.05

3　討　　論

甲狀腺腺瘤是起源于甲狀腺濾泡細胞的良性腫瘤，目前認為本病多為單克隆性，是由與甲狀腺癌相似的刺激所致，好發(fā)于甲狀腺功能的活動期。甲狀腺腺瘤有癌變的可能，并可引起甲狀腺功能亢進癥，對患者的生活質(zhì)量和生命健康影響較大，因此研究甲狀腺腺瘤的發(fā)病機制，對于甲狀腺腺瘤的臨床診斷、以及對于甲狀腺腺瘤新治療藥物的研究均具有非常重要的意義。

Wnt/β-catenin信號通路中的β-catenin蛋白是一種多功能的細胞漿蛋白質(zhì)，在疾病狀態(tài)下，由于體內(nèi)環(huán)境的變化，游離的β-catenin蛋白進入細胞核，參與調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達[11-13]。本研究結(jié)果提示，甲狀腺腺瘤患者Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1，β-catenin蛋白表達上調(diào)，甲狀腺腺瘤組腫瘤組織Wnt-1，β-catenin表達陽性率高于對照組Wnt-1，β-catenin表達陽性率，Wnt-1表達與甲狀腺腺瘤患者腫瘤直徑密切相關(guān)，β-catenin表達也與甲狀腺腺瘤患者腫瘤直徑密切相關(guān)，結(jié)果提示，Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1，β-catenin蛋白表達水平與甲狀腺腺瘤疾病的生物學(xué)狀態(tài)密切相關(guān)，Wnt/β-catenin信號通路的激活可能在甲狀腺腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

綜述所述，甲狀腺腺瘤患者Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1，β-catenin蛋白表達上調(diào)，且其表達與甲狀腺腺瘤的腫瘤生物學(xué)狀態(tài)密切相關(guān)，為今后通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路為措施的靶向治療甲狀腺腺瘤提供了實驗依據(jù)。