黃酮苯并咪唑衍生物的合成及體外抗腫瘤活性研究

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(南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽(yáng) 421001)

黃酮是一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于自然界中，表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)活性。在過去數(shù)十年中，大量天然、半合成和全合成的黃酮類化合物已被開發(fā)用于各種疾病的治療，如抗腫瘤[1]，抗炎[2]，抗菌[3]，抗氧化[4]等。

苯三甲氧基在抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)中具有較高的研究?jī)r(jià)值，特別是在血管阻斷劑的設(shè)計(jì)中。目前處于臨床研究的血管阻斷劑候選藥物中，CA4P[5]及其類似物OXi4503[6]和AVE8062[7]，以及秋水仙堿類似物ZD6126[8],BNC105[9]和CKD-516[10](圖1)結(jié)構(gòu)中均含苯三甲氧基基團(tuán)。

此外，苯并咪唑類化合物也已被廣泛用于抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)。苯并咪唑及其衍生物通過抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂和增殖，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)[11]。因此，在本文中，苯三甲氧基在黃酮B環(huán)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，再與苯并咪唑類化合物衍生化得到9個(gè)全新的3′4′5-三甲氧基-7-羥基黃酮苯并咪唑衍生物，并初步評(píng)價(jià)其體外抗腫瘤活性。

圖1　CA4P，OXi4503，AVE8062，ZD6126，BNC-105和CKD-516的結(jié)構(gòu)

1　材料與方法

1.1主要試劑間苯二酚(98%)、3,4,5-三甲氧基苯甲醛(98%)、氯乙腈(98%)、1，2-二溴乙烷(98%)、1，3-二溴丙烷(98%)、1,4-二溴丁烷(98%)、2-甲基苯并咪唑(98%)、2-氯苯并咪唑、(98%)、2-三氟甲基苯并咪唑(98%)購(gòu)于阿拉丁試劑；胎牛血清FBS、RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Gibco 公司)；柱層析硅膠板(安徽躍化硅材料有限公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.2主要儀器Thermo Scientific Electrothermal Digital熔點(diǎn)測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)，Bruker AV-400型光譜儀(美國(guó)Bruker公司)，Waters GCT質(zhì)譜儀(英國(guó)Waters公司)，WellscanMK-2酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)。

1.3方法

1.3.1化學(xué)合成目標(biāo)化合物4-12采用的合成路線如圖2所示。3′4′5-三甲氧基-7-羥基黃酮(2)的合成：將間苯二酚(2.5 g,0.023 mol)置于100 mL的三頸瓶中，加入無(wú)水乙醚30 mL，冰浴冷卻，原料溶解完全后加入氯乙腈(2 mL,0.032 mol)與催化量的無(wú)水氯化鋅，充分混勻，通入干燥氯化氫，3 h后將反應(yīng)瓶4 ℃放置1 天，再通氯化氫2 h，4 ℃放置1 天，過濾，無(wú)水乙醚洗滌橘黃色沉淀，適量熱水將洗滌后的橘黃色沉淀溶解于圓底燒瓶中，水浴加熱回流1 h，4 ℃靜置過夜，抽濾，即得到化合物2′-羥基-2-氯苯乙酮(1)。將化合物1 (2.2 g,0.012 mol)與3,4,5-三甲氧基苯甲醛(2.0 g,0.01 mol)混合，加入20 mL 95%乙醇溶解，搖勻，慢慢加入10 mL 10% NaOH，室溫下攪拌2 天，用10% HCl調(diào)節(jié)pH至有黃色沉淀析出，抽濾，沉淀用無(wú)水乙醇溶解，緩慢滴加蒸餾水直至有結(jié)晶出現(xiàn)，靜置過濾即得到化合物3′4′5-三甲氧基-7-羥基黃酮(2)。7-(2-溴乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3a)的合成：在250 mL圓底燒瓶依次加入化合物2(0.1 mol)、1，2- 二溴乙烷(0.4 mol)和少量的無(wú)水碳酸鉀，丙酮溶液中(100mL)回流9 h(反應(yīng)用薄層色譜法監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完全后減壓蒸干丙酮，通過硅膠柱分離純化，洗脫劑為二氯甲烷-甲醇(100∶1)?；衔?-(3-溴丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3b)和7-(4-溴丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3c)的合成：與化合物2a合成方法類似。7-(2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(4)：在100 mL圓底燒瓶依次加入化合物2a(0.01 mol)、2-甲基苯并咪唑(0.02 mol)和碳酸鉀(0.02 mol)，溶解于30 mL丙酮，加熱回流約12 h。反應(yīng)完全后減壓蒸干丙酮，通過硅膠柱分離純化，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇(150∶1)?；衔?-12的合成：與化合物4合成方法類似。

圖2　黃酮苯并咪唑衍生物4-12的合成路線

1.3.2體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)采用MTT法研究化合物4-12對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2的體外抗增殖活性，以5-氟尿嘧啶作為陽(yáng)性對(duì)照。胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞均在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為8×103/孔，24 h后用不同濃度(256，128，64，32，16，8，4，2 μmol/L)的化合物進(jìn)行了處理。48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。4 h后，每個(gè)孔加入150 μL的DMSO溶解晶體，并在490 nm處測(cè)量吸光度。50%細(xì)胞的抑制濃度(IC50)是由Logit法測(cè)定的。所有實(shí)驗(yàn)均操作三次。

2　結(jié)　　果

2.1目標(biāo)化合物的表征7-(2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(4)：橘黃色粉末,產(chǎn)率: 53%，Mp:192-193℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.71-7.67(m,1H),7.66(s,1H),7.37-7.32(m,1H),7.27-7.25(m,2H),7.10(s,1H),6.73(s,1H),6.68(d,J=2.0 Hz,1H),6.66(d,J=2.1 Hz,1H),6.60(d,J=2.0 Hz,1H),4.59(t,J=5.3 Hz,2H),4.39(t,J=5.2 Hz,2H),3.92(t,J=8.8 Hz,9H),2.72(s,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.69(s),167.90(s),165.30(s),153.28(s),152.04(s),147.09(s),142.65(s),139.89(s),134.82(s),127.63(s),126.01(s),122.38(s),122.30(s),119.36(s),115.55(s),112.63(s),111.98(s),108.83(s),108.75(s),97.29(s),66.71(s),61.02(s),56.22(s),42.97(s),14.11(s). MS(ESI):486.1(C28H26N2O6,[M+H+])。

7-(2-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(5)：黃色粉末,產(chǎn)率: 78%，Mp:153-156℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.70(d,J=7.1 Hz,1H),7.66(d,J=8.5 Hz,1H),7.44(d,J=7.4 Hz,1H),7.37-7.26(m,2H),7.11(s,1H),6.73(s,1H),6.68(d,J=2.1 Hz,1H),6.66(d,J=2.1 Hz,1H),6.63(d,J=2.0 Hz,1H),4.66(t,J=5.4 Hz,2H),4.41(dd,J=10.6,5.1 Hz,2H),3.92(t,J=8.7 Hz,9H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.69(s),167.92(s),165.23(s),153.31(s),147.11(s),141.74(s),140.49(s),140.14-139.67(m),135.28(s),127.65(s),126.03(s),123.52(s),123.09(s),119.73(s),115.62(s),112.60(s),112.06(s),109.55(s),108.77(s),97.34(s),66.46(s),61.03(s),56.24(s),43.51(s). MS(ESI):507.1(C27H23ClN2O6,[M+H+])。

7-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(6)：黃色粉末，產(chǎn)率: 77%,Mp:207-208℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.91(d,J=8.0 Hz,1H),7.67(t,J=8.3 Hz,2H),7.51(t,J=7.5 Hz,1H),7.42(t,J=7.6 Hz,1H),7.12(s,2H),6.74(s,1H),6.71-6.58(m,2H),4.82(s,2H),4.47(s,2H),3.94(t,J=8.2 Hz,9H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.70(s),167.93(s),165.11(s),153.32(s),147.08(s),141.08(s),139.97(s),135.82(s),127.62(s),126.04(s),125.71(s),124.07(s),121.84(s),115.66(s),112.69(s),112.11(s),110.89(s),108.81(s),97.20(s),66.95(s),61.03(s),56.25(s),44.08(s). MS(ESI):540.1(C28H23F3N2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4--酮(7)：黃色粉末,產(chǎn)率: 57%，Mp:169-171℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.62(t,J=8.8 Hz,2H),7.19(t,J=12.3 Hz,2H),7.11(td,J=14.2,6.7 Hz,3H),6.67(d,J=11.4 Hz,2H),6.56(s,1H),4.30(t,J=6.3 Hz,2H),3.90(dd,J=12.8,7.5 Hz,2H),3.83(d,J=3.5 Hz,9H),2.44(d,J=42.5 Hz,2H),2.28(dd,J=11.8,5.7 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.74(s),168.14(s),165.86(s),153.29(s),151.52(s),147.19(s),142.44(s),139.89(s),134.88(s),127.69(s),126.02(s),122.32(s),122.15(s),119.12(s),115.32(s),112.50(s),112.32(s),109.01(s),108.76(s),97.19(s),64.76(s),61.00(s),56.21(s),40.07(s),28.84(s). MS(ESI):500.1(C29H28N2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(8)：黃色粉末,產(chǎn)率: 66%，Mp:140-142℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.72(t,J=7.8 Hz,1H),7.56(s,1H),7.37-7.29(m,2H),7.14(s,2H),7.07(s,1H),6.76(d,J=6.8 Hz,1H),6.65(s,1H),4.49(t,J=5.7 Hz,2H),4.09(d,J=20.6 Hz,2H),3.93(d,J=6.5 Hz,9H),2.40(s,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.89(s),168.18(s),165.98(s),153.31(s),147.24(s),141.59(s),140.51(s),139.87(s),135.03(s),128.92(s),127.73(s),126.04(s),123.52(s),123.10(s),123.03(s),119.53(s),115.29(s),112.59(s),112.36(s),109.27(s),108.77(s),97.22(s),64.90(s),61.05(s),56.25(s),41.00(s),29.28(s),28.76(s). MS(ESI):521.1(C28H25ClN2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(9)：黃色粉末,產(chǎn)率: 72%，Mp:175-178℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.91(d,J=6.4 Hz,1H),7.75(d,J=8.4 Hz,1H),7.40(dd,J=15.9,8.3 Hz,3H),7.15(s,2H),6.78(d,J=6.8 Hz,2H),6.68(s,1H),4.62(t,J=6.8 Hz,2H),4.14(s,2H),3.95(t,J=10.9 Hz,9H),2.45(d,J=5.6 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.89(s),168.17(s),165.94(s),153.31(s),147.23(s),141.00(s),139.88(s),135.45(s),127.72(s),126.03(s),125.69(s),123.99(s),123.64(s),121.72(s),115.32(s),112.64(s),112.31(s),110.30(s),108.78(s),97.22(s),65.17(s),61.04(s),56.21(s),41.80(s),29.57(s). MS(ESI):554.1(C29H25F3N2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(10)：黃色粉末,產(chǎn)率: 61%，Mp:160-163℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.71(d,J=8.2 Hz,2H),7.31(s,1H),7.25(d,J=3.2 Hz,2H),7.15(s,2H),6.77-6.65(m,3H),4.23(t,J=6.9 Hz,2H),4.10(dd,J=14.1,8.6 Hz,2H),3.94(t,J=10.4 Hz,9H),2.64(s,3H),2.15-1.99(m,2H),1.89(d,J=6.3 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.77(s),168.20(s),166.39(s),153.32(s),151.32(s),147.29(s),142.71(s),135.06(s),127.78(s),125.95(s),122.10(s),121.93(s),119.23(s),115.07(s),112.27(s),112.20(s),109.04(s),108.76(s),97.21(s),68.17(s),61.04(s),56.25(s),43.49(s),26.60(s),26.45(s),14.05(s). MS(ESI):514.1(C30H30N2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(11)：黃色粉末,產(chǎn)率: 60%，Mp:163-166℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.61(q,J=8.0 Hz,3H),7.33-7.12(m,4H),6.75-6.50(m,3H),4.24(t,J=6.7 Hz,2H),4.01(t,J=5.5 Hz,2H),3.85(t,J=9.3 Hz,9H),2.13-1.92(m,2H),1.89-1.74(m,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.78(s),168.19(s),166.40(s),153.31(s),147.29(s),141.79(s),140.45(s),139.85(s),134.94(s),127.78(s),125.93(s),123.27(s),122.80(s),119.63(s),115.04(s),112.26(s),112.23(s),109.35(s),108.75(s),97.21(s),69.53(s),68.06(s),61.03(s),56.23(s),53.80(s),53.47(s),44.11(s),31.76(s),29.28(s),26.24(s),26.18(s). MS(ESI):534.1(C29H27ClN2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(12)：黃色粉末,產(chǎn)率: 63%，Mp:153-156℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.92(d,J=7.8 Hz,1H),7.72(t,J=8.4 Hz,1H),7.48(q,J=8.0 Hz,2H),7.42(dd,J=14.8,7.5 Hz,1H),7.17(s,2H),6.81-6.68(m,2H),5.32(s,1H),4.47(t,J=7.3 Hz,2H),4.15(t,J=5.1 Hz,2H),3.96(t,J=10.3 Hz,9H),2.25-2.09(m,2H),1.98(s,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.79(s),168.20(s),166.33(s),153.32(s),147.28(s),141.21(s),139.87(s),135.31(s),127.78(s),125.96(s),125.46(s),123.78(s),121.87(s),115.13(s),112.29(s),112.22(s),110.42(s),108.76(s),97.22(s),68.03(s),61.03(s),56.23(s),53.45(s),44.77(s),26.86(s),26.26(s). MS(ESI):568.2(C30H27F3N2O6,[M+H+])。

2.2體外抗腫瘤活性化合物4-12的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1?；衔?-12對(duì)MGC-803細(xì)胞株和MCF-7細(xì)胞株更為敏感，IC50值基本小于100 μmol/L?；衔?和11對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶。其中，化合物8的體外抗腫瘤活性最好，對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2的IC50值分別為20.47±2.07 μmol/L、43.42±3.56 μmol/L和35.45±2.03 μmol/L，均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶。

3　討　　論

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，常用治療以化療為主。但大多數(shù)化療藥物毒性大、不良反應(yīng)多等原因限制了其在臨床方面的應(yīng)用。黃酮類化合物因其潛在的腫瘤治療效果和可靠的治療安全性已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[12-13]。而苯并咪唑類化合物具有廣泛的生物活性，近些年其抗腫瘤活性方面的研究和開發(fā)活躍，進(jìn)展迅速[14-15]。根據(jù)藥效基團(tuán)拼合原理，在本研究中共合成了9個(gè)黃酮苯并咪唑衍生物，通過體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，黃酮苯并咪唑衍生物具有良好的抗腫瘤作用。由于碳鏈數(shù)的差異并不大，在本研究中鏈長(zhǎng)的增加對(duì)體外抗腫瘤活性的影響并不顯著。其中化合物8體外抗腫瘤活性較好，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶，值得進(jìn)一步探究其抗腫瘤活性與活性機(jī)制，為尋找新型的靶向抗腫瘤藥物提供新的思路。

表1　化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外抗活性的測(cè)定