核桃內(nèi)生生防菌Ht-q6乳懸劑助劑的篩選

鄭婷婷，李 磊，徐 敏，王美琴

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

近年來，隨著人們對食品安全、環(huán)境污染及生態(tài)平衡等一系列問題的重視，減少化肥和農(nóng)藥的使用，研制和開發(fā)微生物菌肥及生防菌劑已成為植保界和農(nóng)藥界共同關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。微生物菌劑按照有效成分的不同，可分為細(xì)菌類、真菌類和病毒類，其中，細(xì)菌類微生物菌劑主要是以芽孢桿菌為有效成分[2-4]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）能夠形成具有耐熱、耐旱、抗紫外線的芽孢且易于繁殖，對不良環(huán)境具有很強(qiáng)抵抗力，還可以分泌抗生素、抗菌蛋白和多肽類等多種抗菌活性物質(zhì)，不僅可以殺死植物病原物，還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，從而成為生防菌劑的良好材料[5-7]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，在我國，科研工作者對具有生防作用的芽孢桿菌進(jìn)行了廣泛研究，如張榮勝等[8]篩選到1株解淀粉芽孢桿菌Lx-11，對細(xì)菌性條斑病菌的田間防效達(dá)60.2%，顯著高于化學(xué)藥劑20%葉枯唑防效；王奕文等[9]從甜瓜表面分離到1株解淀粉芽孢桿菌，對灰葡萄孢、鏈格孢和尖孢鐮刀菌等8種果蔬病原真菌具有廣譜的拮抗作用。在美國，Agraquest公司開發(fā)的活菌殺菌劑 Serenade TM和Sonata AS，可防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等病害。澳大利亞開發(fā)的Bacillus subtilis A-13對麥類和胡蘿卜立枯病以及其他土傳病害具有很好的防治和增產(chǎn)作用[10]。但是，目前對芽孢桿菌的研究仍主要集中在室內(nèi)生防菌株的鑒定與篩選、抑菌試驗(yàn)、促生作用、發(fā)酵條件及抑菌機(jī)理等方面，真正運(yùn)用在實(shí)踐當(dāng)中并登記的生防菌劑還很少[11]。

生防菌劑的劑型較多的是可濕性粉劑、懸浮劑及顆粒劑，其中，乳懸劑為懸浮劑中的一種，是以溶劑油為主要成分，添加不同的助劑，如乳化劑、抗生素、防凍劑等，加工制成高效無公害、性質(zhì)穩(wěn)定、對人和環(huán)境安全的微生物農(nóng)藥制劑[12-13]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病害與生物防治課題組前期篩選鑒定出1株核桃內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（B.amylol-iquefaciens）Ht-q6（專利號：ZL 201410469787.6），室內(nèi)研究證明，該菌株抑菌譜廣、易在植物體內(nèi)定殖及作用穩(wěn)定，具有開發(fā)研制生防菌劑的潛力[14]。

本試驗(yàn)以Ht-q6菌株為材料，以目前生產(chǎn)上危害嚴(yán)重的番茄早疫病菌為指示菌，通過助劑的篩選，按照國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，研制出生防菌Ht-q6乳懸劑，旨在為生產(chǎn)上開發(fā)應(yīng)用提供資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為生防菌Ht-q6和番茄早疫病菌（Alternaria solani），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

溶劑油為芥末油、花椒油、芝麻油、花生油、胡麻油。乳化劑為吐溫-80和OP-10。抗生素為兩性霉素、灰黃霉素、制霉菌素。防凍劑為氯化鈣、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇。潤濕劑為十二烷基苯磺酸鈉，洗衣粉，D-317，DCM-82。穩(wěn)定劑為 CaCO3，K2HPO4，KH2PO4，CHC-Na。保護(hù)劑為抗壞血酸、羧甲基纖維素、糊精、熒光增白劑。培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生防菌Ht-q6發(fā)酵液的制備 用接種環(huán)挑取生防菌Ht-q6，通過平板劃線培養(yǎng)法，將其接種于NA平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)24 h，然后將活化菌株接種到100 mLNB培養(yǎng)液中，接種量1%，置于搖床上，以30℃，180 r/min速度振蕩培養(yǎng)72 h，芽孢率≥90%。

1.3.2 番茄早疫病菌芽孢懸浮液的制備 取番茄早疫病菌接種在PDA平板上，將其置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用無菌刀把培養(yǎng)物切成5 mm×5 mm的菌塊，接入水瓊脂培養(yǎng)液中，黑暗放置3 d后產(chǎn)生大量分生孢子，用無菌水稀釋振蕩均勻，得到濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液[15]。

1.3.3 生防菌Ht-q6乳懸劑助劑篩選

1.3.3.1 溶劑油和乳化劑的篩選[16]溶劑油：取1 mL生防菌Ht-q6發(fā)酵液分別加入到10 mL不同的溶劑油中，置于小錐形瓶內(nèi)，密封后室溫下貯存，并定期取0.1 mL加入到10 mL的NB培養(yǎng)液中，測定其芽孢存活率。

乳化劑：將選出的最佳溶劑油取10 mL置于小錐形瓶中，分別加入1 mL的吐溫-80，OP-10及吐溫-80和OP-10（體積比為1∶1）的混合物，再向其中加入1 mL的發(fā)酵液，振蕩均勻后，測定芽孢存活率。每隔7 d取0.1 mL分別加入到10 mL不同濃度的最佳乳化劑中，振蕩均勻后測定芽孢存活率。

以上各處理均在（25±1）℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，用平板菌落計(jì)數(shù)法測定并記錄不同時(shí)間芽孢存活率，以芽孢存活率的高低判定溶劑油優(yōu)劣以及測定不同乳化劑對芽孢活性的影響。

1.3.3.2 抗生素的篩選 將已經(jīng)篩選出的溶劑油和乳化劑的最佳配比與生防菌Ht-q6發(fā)酵液混合制成乳液，然后將不同抗生素按照質(zhì)量濃度為5，15，25，50 μg/mL加到乳液中。將番茄早疫病菌孢子懸浮液均勻涂布在PDA平板上，自然晾干后在平板中央打一直徑為5 mm的孔。用移液槍取5 μL上述處理的乳液于孔中，每個(gè)處理3次重復(fù)，以不加抗生素的乳液作為對照。將所有平板置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，測量抑菌圈直徑。

1.3.3.3 防凍劑的篩選 取1 mL不同防凍劑分別加入到10 mL生防菌Ht-q6發(fā)酵液中充分混合，稀釋后取0.5 mL均勻涂布于NA平板上，以不加防凍劑的發(fā)酵液為對照組，每個(gè)處理3次重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱中（25±1）℃下培養(yǎng)，3 d后采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定芽孢存活率，篩選最佳防凍劑。將篩選出的防凍劑，按2%，4%，6%，8%和10%等5種濃度分別與發(fā)酵液10 mL混合，以蒸餾水為對照，對照組始終置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，各處理前24 h置于（0±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后與對照組的培養(yǎng)條件一致，培養(yǎng)3 d后記錄芽孢存活率，篩選出最佳防凍劑濃度。

1.3.3.4 潤濕劑和穩(wěn)定劑的篩選 將4種潤濕劑（10%）和4種穩(wěn)定劑（2%）分別添加到已經(jīng)篩選出的上述配方中，測定添加潤濕劑和穩(wěn)定劑后的懸浮率、潤濕時(shí)間和芽孢存活率，每個(gè)處理3次重復(fù)，以不加潤濕劑和穩(wěn)定劑的配方為對照，篩選出最佳潤濕劑和穩(wěn)定劑。

1.3.3.5 保護(hù)劑的篩選[17]將4種保護(hù)劑按10%分別加到已制備的乳懸劑中，測定添加保護(hù)劑的懸浮率、潤濕時(shí)間，以不加保護(hù)劑為對照，在254 nm紫外燈下距離40 cm處照射6，12，24 h后計(jì)算芽孢存活率。

1.3.4 生防菌Ht-q6乳懸劑貯藏時(shí)間的測定 取2 mL試樣和18 mL的無菌水置于100 mL的錐形瓶內(nèi)，振蕩均勻。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，每隔6 d測1次，當(dāng)活菌數(shù)出現(xiàn)大量減少時(shí)，改為每隔3 d測一次，直到活菌數(shù)接近于零，記錄測量間隔時(shí)間及活菌數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出1 mL樣品中的活菌數(shù)。

1.3.5 生防菌Ht-q6芽孢存活率的測定 參考《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)》（GB 4789.2—2010），采用平板菌落計(jì)數(shù)法，測定制劑的芽胞含量。即將乳懸劑按10倍梯度依次稀釋7次后，取最后稀釋液0.1 mL均勻涂布于平板上，計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算菌株存活率（SC）。

其中，M為含生防菌的乳懸劑在NA平板上的菌落數(shù)（cfu/g）；M0表示未添加任何助劑的生防菌在NA平板上的菌落數(shù)（cfu/g），即空白對照。

1.3.6 生防菌Ht-q6乳懸劑質(zhì)量指標(biāo)的測定 按照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》對生防菌Ht-q6乳懸劑的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行測定，如傾倒性、熱貯穩(wěn)定性、低溫穩(wěn)定性、雜菌率、pH和細(xì)度。

傾倒性的測定按HG/T2467.5—2003方法。熱穩(wěn)定性的測定按GB/T 19136—2003方法。低溫穩(wěn)定性的測定按GB/T 19137—2003方法。懸浮率的測定按照GB/T 14825—2006方法；pH值測定按照GB/T1601—1993方法。

1.3.7 生防菌Ht-q6乳懸劑安全性評價(jià)

1.3.7.1 對番茄植株的安全性測定 用接種針蘸取生防菌Ht-q6乳懸劑10倍稀釋液直接穿刺接種番茄葉片和莖部，保濕培養(yǎng)，以穿刺接種無菌水作為對照。然后將番茄苗的根部洗凈，浸根于菌懸液中接種，再將番茄苗移栽至含無菌土的育苗缽中，常規(guī)管理；以根部浸于無菌水為對照，每個(gè)處理5株番茄（5～6片葉），3次重復(fù)。

1.3.7.2 毒理學(xué)測定 依據(jù)國家安全標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15670.2—2017，以大鼠為材料，通過急性經(jīng)口毒性、急性經(jīng)皮毒性和急性皮膚刺激試驗(yàn)，測試生防菌Ht-q6乳懸劑對大鼠的安全性[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑油與乳化劑的篩選結(jié)果

從表1可以看出，芥末油在21 d后芽孢存活率為0，效果最差?；ㄉ吞幚淼难挎叽婊盥逝c其他處理相比，僅在7，14 d時(shí)與芝麻油處理的差異不顯著，其余時(shí)間段與其他處理間差異顯著。故確定花生油為最佳溶劑油。

表1 室溫下不同溶劑油對芽孢存活率的影響

從表2可看出，14 d之前芽孢存活率在66%～100%，其中，OP-10對芽孢的存活率影響最低，與其他處理差異顯著。14 d之后吐溫-80與OP-10混合乳化劑對芽孢存活率的影響減小，與其他處理相比差異顯著，確定選擇該混合物作為乳化劑。由圖1可知，芽孢存活率隨乳化劑添加比例的升高而降低，確定0.2%為混合乳化劑的最佳添加比例。

表2 室溫下不同乳化劑對芽孢存活率的影響

2.2 抗生素的篩選

由表3可知，隨著3種抗生素質(zhì)量濃度的增加，對番茄早疫病菌抑制作用逐漸增強(qiáng)。其中，加入15 μg/mL的制霉菌素和兩性霉素，對番茄早疫病菌抑制作用較好且與對照差異不顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，對乳液的抑菌效果有增效作用?？紤]到價(jià)格和用量問題，最終確定15 μg/mL的制霉菌素添加于生防菌Ht-q6乳懸劑中。

2.3 防凍劑的篩選

由圖2可知，添加丙二醇和丙三醇的處理，芽孢存活率分別為12.2%和19.4%，與其他處理相比具有顯著性差異；氯化鈣、乙醇和乙二醇與對照相比，對芽孢存活率的影響較小。由此得出，氯化鈣、乙醇和乙二醇適合作為防凍劑。

從表4可以看出，當(dāng)防凍劑濃度小于6%時(shí)，隨防凍劑濃度的增加對芽孢的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)乙二醇濃度為6%時(shí)，芽孢存活率最高，達(dá)到85.4%，與其他處理差異顯著，但與對照差異不顯著。因此，確定6%的乙二醇作為乳懸劑的防凍劑。

表4 防凍劑對芽孢的保護(hù)作用

2.4 潤濕劑、穩(wěn)定劑的篩選

從表5可以看出，十二烷基苯磺酸鈉的懸浮率為65.6%，與其他處理相比差異顯著；潤濕時(shí)間為28.5 s與洗衣粉差異不顯著并且芽孢存活率最高，為89.1%。在田間潤濕時(shí)間越短越能發(fā)揮藥效，最終確定十二烷基苯磺酸鈉作為乳懸劑的潤濕劑。

表5 潤濕劑對Ht-q6乳懸劑的影響

從表6可以看出，KH2PO4的懸浮率為77.6%，與其他處理相比差異顯著，潤濕時(shí)間為41.4 s，與K2HPO4差異不顯著。綜合分析潤濕時(shí)間以及對芽孢存活率的影響，選擇效果最佳的KH2PO4為穩(wěn)定劑。

表6 穩(wěn)定劑對Ht-q6乳懸劑的影響

2.5 保護(hù)劑的篩選

由表7可知，抗壞血酸的懸浮率為76.2%，潤濕時(shí)間為（37.4±1.8）d，與其他處理間差異顯著，懸浮效果與潤濕性能最好；抑菌圈直徑與對照組差異不顯著且添加抗壞血酸后對芽孢活性影響小，確定最佳紫外保護(hù)劑為抗壞血酸。

2.6 生防菌Ht-q6乳懸劑質(zhì)量檢測結(jié)果分析

制劑外觀為可流動的乳白色黏稠液體；貯存過程中有少量沉淀或微分層，經(jīng)搖動能恢復(fù)原狀，無結(jié)塊。由表8可知，出生防菌Ht-q6乳懸劑的芽孢含量為2.54×109cfu/mL，雜菌率為0.85%，pH值為7.2，細(xì)度為96.5%，懸浮率為90.5%，傾倒性、低溫穩(wěn)定性和熱貯穩(wěn)定性都符合國家標(biāo)準(zhǔn)值，質(zhì)量合格。

表7 4種紫外保護(hù)劑對Ht-q6乳懸劑的影響

表8 生防菌Ht-q6乳懸劑質(zhì)量檢測結(jié)果

2.7 生防菌Ht-q6乳懸劑貯藏時(shí)間的測定結(jié)果分析

從圖3可以看出，生防菌Ht-q6乳懸劑的活菌量在貯藏前54天時(shí)變化不明顯，減少幅度較小，從54 d開始活菌量變化幅度增大，當(dāng)貯藏80 d時(shí)含量接近于零，說明乳懸劑的有效貯藏時(shí)間為80 d左右，而在54 d之內(nèi)使用效果最佳。

2.8 生防菌Ht-q6乳懸劑安全性測定結(jié)果

2.8.1 乳懸劑對番茄植株的安全性測定 結(jié)果表明，番茄葉片和莖稈用接種針穿刺接種培養(yǎng)3 d后，與對照組沒有明顯差異，番茄植株經(jīng)乳懸劑100倍稀釋液多次澆灌后，無發(fā)病狀況。確定生防菌Ht-q6乳懸劑對番茄植株沒有致病性。

2.8.2 乳懸劑毒理學(xué)測定 急性經(jīng)口毒性和急性經(jīng)皮毒性測試表明，該乳懸劑屬于低毒性。在急性皮膚刺激試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)鼠的皮膚涂抹部位未出現(xiàn)紅斑、水腫，表明乳懸劑對皮膚沒有刺激性。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對溶劑油、乳化劑、防凍劑和抗生素等助劑的篩選，確定了生防菌Ht-q6乳懸劑的最佳配方。經(jīng)檢測，制劑的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)達(dá)到國家要求，毒性測試表明該乳懸劑屬于低毒性，產(chǎn)品配方成本經(jīng)濟(jì)，加工工藝簡單，質(zhì)量穩(wěn)定，為其他生防菌劑助劑的開發(fā)提供了參考。由于乳懸劑在農(nóng)藥制劑中發(fā)展歷史較短，并處于不斷完善中，故在產(chǎn)量上仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳油和可濕性粉劑[19]。

與發(fā)達(dá)國家相比，我國乳懸劑的研究技術(shù)仍然存在很多問題，農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)的自主研發(fā)能力較弱，國內(nèi)現(xiàn)行產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中許多技術(shù)指標(biāo)與國外現(xiàn)行產(chǎn)品存在較大差距。如國內(nèi)的懸浮率在85%以上，而國外一般達(dá)到95%以上。這直接影響了制劑的儲存時(shí)間，同樣也是阻礙此劑型推廣應(yīng)用的一大技術(shù)性難題[20]。本試驗(yàn)制備的乳懸劑有效貯藏時(shí)間（約80 d）與其他芽孢桿菌生防菌劑的有效貯藏時(shí)間（約100 d）相比有些短。因此，為了保持制劑防效和提高貯藏時(shí)間，在制備乳懸劑時(shí)還需要不斷調(diào)整制劑中所添加的助劑種類及范圍。如李農(nóng)昌等[21]在對白僵菌油劑劑型的研究中還分別對抗氧劑、增效劑、稀釋劑進(jìn)行篩選。此配方的實(shí)用性有待田間試驗(yàn)證實(shí)。