球孢白僵菌4種菌株防治柳膜肩網(wǎng)蝽的溫度效應研究

趙俊芳，樊金華，冀衛(wèi)榮

（山西農(nóng)業(yè)大學林學院，山西太谷 030801）

柳膜肩網(wǎng)蝽（Hegesidemus habrus Drake）屬半翅目網(wǎng)蝽科網(wǎng)蝽亞科，是危害柳樹等樹木葉片的一種刺吸式害蟲[1-3]。柳膜肩網(wǎng)蝽不僅通過吸食葉片汁液破壞葉片的各種細胞器，還分泌大量黑褐色黏稠狀物質(zhì)，堵塞氣孔，影響了光合作用和呼吸作用，同時也加重了霉病發(fā)生的概率[4-5]，導致葉片大量失綠，樹木營養(yǎng)缺失，落葉斷枝情況嚴重，觀賞價值大打折扣。柳樹是園林植物中生命力旺盛和觀賞性強的代表樹種[6]，近2 a發(fā)現(xiàn)，柳膜肩網(wǎng)蝽在山西省晉中市太谷縣柳樹上發(fā)生危害嚴重。該蟲一年發(fā)生4～5代，利用蟲生真菌對其進行防治還未見報道，篩選出能替代傳統(tǒng)農(nóng)藥的生物控制因子，是對柳網(wǎng)蝽可持續(xù)控制的重要手段。

目前，針對柳膜肩網(wǎng)蝽的防治方法主要是物理防治和化學防治?；瘜W藥劑的缺點如污染環(huán)境、長期使用容易產(chǎn)生抗藥性等已不能滿足人們的需求，而物理防治不僅效果慢，工作量也大，生物試劑已經(jīng)成為主流[7]。生物試劑的綠色無污染，受到人們的高度肯定[8]。白僵菌作為重要的昆蟲病原真菌，用于防治多種林木害蟲[9-12]，在林間使用，極易形成昆蟲流行病。白僵菌是通過昆蟲體壁進入昆蟲，不需要以取食的方式獲病，所以，對擁有刺吸式口器的柳膜肩網(wǎng)蝽有針對性防治效果。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于通過蟲生真菌防治柳膜肩網(wǎng)蝽的報道。

本試驗通過從已選擇出的4種相對毒性較高的白僵菌，對柳膜肩網(wǎng)蝽進行毒力測試，最終篩選出1種致病性最高的菌株，同時檢測此菌株在不同溫度下的致病力，選出最佳施用溫度，為今后柳膜肩網(wǎng)蝽的生物防治提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株為球孢白僵菌FDB，JLYT，BF，TST菌株，保存于山西農(nóng)業(yè)大學森林生物顯微技術(shù)實驗室。供試昆蟲為柳膜肩網(wǎng)蝽，主要采自山西農(nóng)業(yè)大學試驗苗圃試驗田中的柳樹上。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備 供試4種菌株采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯2 g、葡萄糖0.2 g、瓊脂0.15～0.2 g、蒸餾水10 mL、自然pH）培養(yǎng)，直到白僵菌完全產(chǎn)孢，在無菌環(huán)境下的操作臺里，用接菌環(huán)將分生孢子分別刮到50 mL的小三角瓶里，分別加入等量的20 mL含0.05%吐溫－80的蒸餾水，磁力攪拌器攪拌均勻后，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，了解孢子懸液的初始濃度，根據(jù)所需濃度進行梯度稀釋，最終配制出所需的菌液[13-14]。

1.2.2 同濃度的4種白僵菌的高致病力篩選 選取1.0×108孢子/mL的4種球孢白僵菌孢子懸浮液，分別以相等的量均勻地涂抹在捕捉到的網(wǎng)蝽體表，放入準備好的養(yǎng)蟲籠中。每菌株3個重復，每個重復30頭試蟲。對照為0.1%的吐溫-80溶液。每個籠中有提前準備好的新鮮柳樹枝條，并且在枝條一端綁扎蘸有保鮮液的棉球保濕保鮮。將操作后的試蟲放入恒溫光照培養(yǎng)箱，每天定時定量更換新鮮柳樹枝條。第2天的同一時間所測數(shù)據(jù)為試驗的第一組數(shù)據(jù)，每天定時對試蟲進行統(tǒng)計，直到全部死亡。死后的試蟲及時轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)（RH＞95%），以證明試蟲是由于感染真菌而死。同時，觀察對照組的死亡情況。根據(jù)死亡情況，分別計算出4種菌株在1.0×108孢子/mL時的半致死時間LT50。最終得到死亡率最大、LT50最小的高毒力菌株，并對其進行關(guān)于溫度對菌株致病力影響的研究[15]。

1.2.3 溫度對白僵菌致病力的影響 綜合考慮死亡率和僵蟲率，選擇菌株BF進行后續(xù)的不同溫度對白僵菌致病力的試驗[16-17]。操作方法和不同菌株試驗的接菌方法相同，用1.0×108孢子/mL的菌液接菌后，將養(yǎng)有試蟲的養(yǎng)蟲盒放入不同溫度恒溫培養(yǎng)箱（RH＞95%）。培養(yǎng)箱的溫度分別設(shè)置為18，22，26，30℃，每個溫度3個重復，每個重復30頭試蟲。從試驗的第2天開始觀察統(tǒng)計試驗組和對照組，統(tǒng)計數(shù)值為第1組數(shù)據(jù)。及時處理死亡試蟲，將其放入恒溫培養(yǎng)箱（RH＞95%）保濕培養(yǎng)，從而保證試蟲是由于感染白僵菌致病而死的。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 同濃度的4種白僵菌的高致病力篩選

本研究應用1.0×108孢子/mL的蟲生真菌菌液，對柳膜肩網(wǎng)蝽成蟲進行侵染后，死亡率為70.00%～92.22%，不同菌液造成的試蟲死亡率不同，4 種菌株 FDB，JLYT，BF，TST 的死亡率分別為92.22%，73.33%，91.11%，70.00%，不同菌株的毒力明顯不同。對試蟲死亡率的差異性檢驗結(jié)果顯示，菌株FDB，BF與其他菌株死亡率差異顯著。對試蟲的處理過程中，僵蟲率范圍是44.44%～84.44%，不同菌株 FDB，JLYT，BF，TST 的僵蟲率分別為74.11%，52.22%，84.44%，44.44%；菌株僵蟲率的差異性檢驗顯示，菌株BF的僵蟲率顯著高于其他3種菌株（表1）。說明試蟲的死亡主要由真菌感染引起。

表1 1.0×108孢子/mL的4種菌液侵染柳膜肩網(wǎng)蝽成蟲的死亡率和僵蟲率 %

通過致死中時分析，所選菌株對柳膜肩網(wǎng)蝽的致死中時均在5 d以內(nèi)。其中，菌株FDB和BF對試蟲的LT50均在4 d以內(nèi)，菌株BF更是小于3 d（表2）。說明菌株BF對柳膜肩網(wǎng)蝽的致死速度最快，其次是菌株FDB。

表2 1.0×108孢子/mL的4種菌液侵染柳膜肩網(wǎng)蝽成蟲的半致死時間LT50 d

2.2 溫度對白僵菌致病力的影響

通過對不同溫度下試蟲的校正死亡率比較得出，18～30℃的溫度條件均能造成試蟲侵染致死；在22～26℃時，BF菌液的致死效應較強，在26℃時致死率達到最高。

在不同恒溫（RH＞95%）條件下，BF菌液侵染后的試蟲死亡率和僵蟲率隨溫度的變化而改變（圖1，2）。在18℃時，試蟲的平均死亡率最低，在22，26℃時形成逐漸增加的趨勢，并且達到最大值100%；在30℃時平均死亡率回落。同樣，僵蟲率在18～26℃時呈現(xiàn)上升趨勢，到30℃回落。說明試蟲死亡是由菌液侵染致死。

3 討論

在生物防治方面，蟲生真菌的選擇至關(guān)重要，除了考慮菌種對寄主的?；?，還應關(guān)注菌株對人畜及環(huán)境的影響。本試驗所選的4種菌株均通過了科學的驗證，對人畜及作物無害，且是針對昆蟲的毒性較強的菌株，完全可以直接投入實踐。4種菌株制成1×108孢子/mL的菌液，用均勻涂抹的方式感染柳膜肩網(wǎng)蝽，以保證菌液與蟲體充分接觸和蟲體單位面積的受侵染量相同。侵染后，統(tǒng)計死亡率和僵蟲率可知，綜合考慮二者確定試蟲的致死是由于菌液的侵染。結(jié)果表明，菌株FDB對柳膜肩網(wǎng)蝽的累計死亡率達到92.22%，在4種菌株中死亡率最高，而菌株BF的死亡率是91.11%，僅次于菌株FDB，但是，菌株BF的僵蟲率達到了84.44%，高于其他3種菌株。此外，致死中時LT50也是關(guān)于高毒力的一個重要影響因素。致死中時越短，說明菌株的毒性越強，目標害蟲的死亡速度越快，防治效果越好。本試驗中4種菌株的致死中時均小于5 d，菌株BF和FDB的致死中時小于4 d，BF更是達到了2.33 d的水平。說明所選4種球孢白僵菌對柳膜肩網(wǎng)蝽均有較高的致病力，可作為生物試劑應用于實際防治中。

針對高毒力菌株試驗結(jié)果，綜合考慮死亡率、僵蟲率以及致死中時LT50，篩選出菌株BF是4種菌株中具有高毒力、高致病力的菌株。為了在實際生產(chǎn)中更好地使用該菌株，本試驗選擇單一菌株BF，測試了1×108孢子/mL下不同溫度對菌株的致病力的影響[20]。低溫會影響球孢白僵菌的萌發(fā)和對試蟲的侵染，高溫會通過提高酶活而影響孢子的活性[21]。研究結(jié)果表明，柳膜肩網(wǎng)蝽在18～26℃時的死亡率一直處于上升狀態(tài)，到26℃時死亡率為100%，對柳膜肩網(wǎng)蝽的致病力最強；溫度繼續(xù)升高，死亡率開始下降。說明隨著溫度的升高，菌株的致病力并不是持續(xù)升高的，而是有一個最適溫度范圍。

試驗中，在1×108孢子/mL的濃度下，篩選出的高致病力菌株BF，死亡率達到了91%以上，半致死時間為2 d左右，在投入實踐時，可以考慮在春秋或者夏季的早晚施用BF菌液制備的生物殺蟲劑，該菌株毒性可以發(fā)揮到最大，殺蟲效果更好。