桑樹MaPP2-B15基因的克隆、表達與序列特征分析

楊金宏，孔衛(wèi)青

（安康學院，陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康 725000）

白粉病廣泛發(fā)生在黃瓜、小麥、草莓、蘋果、葡萄、甜瓜等多種作物中，患病植株的葉片散生白色細小霉斑，擴大后連成一片，布滿葉背，病斑中央密生黃色小顆粒，逐漸增多，由黃色轉(zhuǎn)橙紅變褐，最后變成黑色，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。黃瓜白粉病是黃瓜栽培中的常見病害之一，ZHANG等[1]（2015）在黃瓜對白粉病抗性基因的研究中發(fā)現(xiàn)，黃瓜Csa5M650450.1參與了該病的防御反應(yīng)，該基因是擬南芥AtPP2-B15的同源基因，這是一類N端為F-box結(jié)構(gòu)，C端為PP2結(jié)構(gòu)的F-box蛋白（F-boxprotein，F(xiàn)BP），廣泛存在于酵母、擬南芥、小麥、蘋果等真核生物中[2-5]。

FBP是泛素連接酶的成分之一，參與植物信號轉(zhuǎn)導、內(nèi)噬作用、免疫、DNA修復以及蛋白降解等[2-3，6-8]。同時，PP2-B15 還與植物生長負相關(guān)，對 Cd壓力敏感，可以作為Cd壓力生物標記的候選[3，9-10]。番茄中PP2-B15是應(yīng)對salinity壓力的調(diào)節(jié)者[11]。MORANLAUTER等[12]利用鐵缺陷型培養(yǎng)基對大豆進行處理，對參與大豆根和葉中早期缺鐵黃化病的信號基因進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與擬南芥AtPP2-B15同源基因在處理6 h后的根中表達上調(diào)。

桑里白粉病又稱白背病，廣泛分布于我國大多數(shù)蠶區(qū)，主要對晚秋桑葉造成危害，使桑葉提前硬化，營養(yǎng)下降，嚴重時桑葉脫落，家蠶拒食桑葉，影響正秋蠶和晚秋蠶期的養(yǎng)蠶生產(chǎn)。通過桑里白粉病被害葉不同齡期養(yǎng)蠶成績的調(diào)查可知，該病葉片對幼蟲生命力及繭質(zhì)有較大的影響[13]。

根據(jù)已有研究對PP2-B15作用的描述，本研究利用同源克隆技術(shù)，獲得了桑樹中的同源基因MaPP2-B15，并對其在桑樹葉片、葉柄、葉脈以及枝條桑樹韌皮部組織中的表達情況進行了研究，旨在為進一步研究該基因在桑樹中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料選取陜西省種植面積較大且對桑里白粉病具有一定抗性的強桑一號，取自安康學院恒口蠶?？蒲谢兀⌒迈r葉片、葉柄、葉脈、韌皮部組織等提取總RNA。

1.2 MaPP2-B15基因的生物信息學分析與引物設(shè)計

基因信息從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://morus.swu.edu.cn/morusdb/filebrowser）的桑樹同源基因數(shù)據(jù)庫獲取[14]，以PP2-B15為目標對功能列進行檢索過濾，獲得一個ID為MOPG06953的桑樹同源基因，及其對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本L484_007289的氨基酸序列。利用該序列對桑樹基因組數(shù)據(jù)庫進行比對tblastn檢索，獲得桑樹同源基因序列。primer premier 5.0 軟 件 設(shè) 計 引 物 序 列 為 ：7289F：5′-ATGTTTTTACCAGAAGACTGTG-3′；7289R：5′-TGTTAGTCCTTAG-GCCTCACT-3′，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 桑樹葉片RNA的提取與MaPP2-B15基因的RT-PCR擴增

植物RNA提取試劑盒（Tiangen生化科技（北京）有限公司）完成桑樹葉片總RNA的提取，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解提取的總RNA，配制1.2%瓊脂糖凝膠，對總RNA進行電泳，檢測RNA的完整性，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（北京全式金生物技術(shù)有限公司）對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到第1鏈cDNA，以此為模板，以7289F和7289R引物和NEB公司Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預變性 3 min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；最后72℃終延伸8 min。配制1.2%瓊脂糖凝膠，對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.4 MaPP2-B15基因的克隆測序與序列分析

對PCR擴增產(chǎn)物進行回收純化，連接pGEM-T載體（Promega）進行克隆。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌感受態(tài)細胞，陽性克隆進行雙向測序（生工生物工程（上海）有限公司）。運用sim4程序?qū)λ没蛐蛄械慕Y(jié)構(gòu)進行分析，序列推定蛋白的分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)通過在線EXPASY（http://www.expasy.org/）網(wǎng)站進行分析，NCBI在線BLASTP比對對序列的相似性進行分析，在線CDD預測基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，多重比對分析及分析結(jié)果的著色利用Clustal X 1.83軟件和Boxshade（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）網(wǎng)站進行。

1.5 MaPP2-B15基因的表達

提取桑樹葉片、葉脈、葉柄和枝條桑樹韌皮部組織的RNA，運用7289F和7289R引物進行RT-PCR擴增，擴增循環(huán)數(shù)為25，其他同1.3，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳擴增產(chǎn)物，EB染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹MaPP2-B15基因PCR擴增和克隆測序

以桑樹葉片為材料，進行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄，利用7289F，7289R引物對進行桑樹MaPP2-B15基因的PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果在約800 bp處獲得單一條帶（圖1），與預期大小相符。回收該擴增條帶并進行克隆測序，獲得基因的序列818 bp（圖 2，GenBank 登錄號：MG546686）。

2.2 桑樹MaPP2-B15基因序列分析

2.2.1 MaPP2-B15基因結(jié)構(gòu)分析 以桑樹基因組框架圖為參照，運用sim4程序分析桑樹MaPP2-B15基因位置結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示，基因有3個外顯子，外顯子內(nèi)含子邊界符合gt/ag規(guī)則（圖2）。

2.2.2 桑樹MaPP2-B15蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析MaPP2-B15基因編碼271個氨基酸，其中，正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）31個，負電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu）38個，理論等電點（pI）5.49，是一種酸性蛋白質(zhì)。分子式為C1363H2128N364O417S14，分子質(zhì)量為30.735 ku。預測蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為43.96，是一種不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)和氨基酸殘基總平均疏水系數(shù)（GRAVY）分別為79.11和-0.384，是親水蛋白（圖 3）。

預測基因編碼的3～44位氨基酸為F-box結(jié)構(gòu)域，94～269位氨基酸為植物韌皮部蛋白結(jié)構(gòu)PP2結(jié)構(gòu)域（圖4），具有凝集素活性或結(jié)合RNA的特征。

在線BLASTP程序比對MaPP2-B15基因編碼的氨基酸序列，與川桑（Morus notabilis）的F-box蛋白（EXB60973）一致性為97%，與核桃（Juglans regia，XP_018858311）、土瓶草（Cephalotus follicularis，GAV67823）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002279245）、木薯（Manihot esculenta，OAY44004）、橙子（Citrus sinensis，KDO70549）、橡膠樹（Hevea brasiliensis，XP_021682309）、榴蓮（Durio zibethinus，XP_022719471）、毛 果 楊 （Populus trichocarpa，ERP60237）、 可 可（Theobroma cacao，EOY11556）、麻風樹（Jatropha curcas，KDP38872）、蓖麻（Ricinus communis，EEF 33114）、番木瓜（Carica papaya，XP_021898946）等的F-box蛋白PP2-B15一致性在55%以上，相似性均在70%以上。多重序列比對顯示，MaPP2-B15蛋白的F-box和PP2結(jié)構(gòu)域在各物種間比較保守，F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)的保守氨基酸及其位點符合該結(jié)構(gòu)的典型特征（圖 5）。

2.3 MaPP2-B15基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測

RT-PCR對MaPP2-B15基因在桑樹葉片、葉柄、葉脈和枝條韌皮部組織等中表達進行檢測，電泳檢測結(jié)果顯示，基因在所檢測的各桑樹組織中均有表達（圖6）。

3 結(jié)論與討論

FBP由位于該類蛋白N端的F-box結(jié)構(gòu)域和位于C端的與蛋白相互作用密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域組成，其中，F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域由大約40～50個氨基酸組成，有幾個氨基酸殘基比較保守，一般為L/MP（6）I/V（3）L/M（11）S/C，其他位置缺少嚴格的保守序列，一般采用三級結(jié)構(gòu)的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫來鑒定。本研究利用在線CDD預測桑樹MaPP2-B15基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，獲得其3～44位為F-box結(jié)構(gòu)域。

FBP家族是擬南芥最大的超家族，不僅參與植物生長素、赤霉素、茉莉酸、乙烯等信號途徑，而且還在植物發(fā)育、逆境以及植物受到不同外界環(huán)境、病原刺激和脅迫時的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[2-3，15]。李彥澤[16]在對擬南芥干旱基因相關(guān)基因的研究中，獲得一個受干旱誘導較明顯的F-box基因AtPP2-B11。本研究桑樹MaPP2-B15基因編碼的94～269位氨基酸為PP2結(jié)構(gòu)域，是植物韌皮部蛋白結(jié)構(gòu)，具有凝集素活性或結(jié)合RNA的特征。RT-PCR技術(shù)檢測MaPP2-B15基因在所調(diào)查的桑樹組織器官中表達量無明顯差異。植物韌皮部蛋白在植物形態(tài)維持、抵御外界物理傷害及抗病方面有較大作用[17-20]。綜合本研究以及前人研究，推測桑樹MaPP2-B15基因可能參與了桑樹的多種生物學功能，對該基因及其功能的進一步研究也將有助于我們對桑樹的生長發(fā)育及逆境生物學的了解。