藏藥懸鉤木的質量標準研究

馬志良　多杰

中圖分類號 R927 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）02-0179-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.09

摘 要 目的：建立藏藥懸鉤木的質量標準。方法：從性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）等方面對藥材進行定性鑒別；測定藥材水分、灰分、浸出物的含量。采用高效液相色譜法測定藥材中蘆丁和金絲桃苷的含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（18 ∶ 82，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結果：藥材表面呈灰紅色至灰紅褐色，有縱向皺溝，外皮易剝離，髓部較大、疏松、呈海綿狀。藥材粉末呈淺黃色，木纖維成束或單個散在，韌皮纖維較粗。藥材樣品中金絲桃苷的TLC圖斑點清晰，分離度好；水分為6.71%～7.55%，總灰分為1.43%～1.67%，酸不溶性灰分為0.41%～0.48%，水浸出物為17.70%～19.31%，醇浸出物為13.76%～16.99%；金絲桃苷、蘆丁檢測質量濃度線性范圍均為3.13～50 μg/mL（r分別為0.999 2、0.999 5）、定量限分別0.5、1.8 μg/mL，檢測限分別為0.2、0.9 μg/mL，精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD<2.0%（n=6），加樣回收率分別為92.8%～98.8%（RSD=2.25%，n=9）、94.0%～98.6%（RSD=1.71%，n=9）。結論：藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、3.0%、0.6%；水浸出物、醇浸出物、蘆丁和金絲桃苷總量分別不得少于15.0%、12.0%、1.0 mg/g。所建標準可用于藏藥懸鉤木的質量控制。

關鍵詞 藏藥；懸鉤木；質量標準；蘆?。唤鸾z桃苷；薄層色譜法；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Tibetan medicine Rubus biflorus. METHODS： The qualitative identification was conducted from characters characteristics， microscopic characteristics， TLC. The contents of moisture， ash and extract were determined. HPLC method was adopted for content determination of rutin and hyperoside. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution（18 ∶ 82，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 360 nm， column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The surface of the medicinal material was grayish red to grey red brown， with longitudinal wrinkle grooves， and the peel was easy to peel off. The pith of the medicinal material was large， loose， sponge-like. The powder of the medicine was light yellow； wood fiber was bundle or scattered individually； bast fiber was thick. TLC spot of hyperoside was clear and well-separated. The contents of moisture， total ash， acid-insoluble ash， water-soluble extract and ethanol extract were 6.71%-7.55%， 1.43%-1.67%， 0.41%-0.48%， 17.70%-19.31% and 13.76%-16.99%. The linear range was 3.13-50 μg/mL for rutin （r=0.999 2） and hyperoside （r=0.999 5）. The limits of quantitation were 0.5，1.8 μg/mL， and the limits of detection were 0.2，0.9 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. The recoveries were 92.8%-98.8%（RSD=2.25%，n=9），94.0%-98.6%（RSD=1.71%，n=9） . CONCLUSIONS： The moisture content， total ash and acid insoluble ash content of medicinal materials is not more than 10.0%， 3.0% and 0.6%， respectively. The total amount of water extract， alcohol extract， rutin and hyperoside is not less than 15.0%， 12.0%， 1.0 mg/g， respectively. Established standard can be used for quality control of Tibetan medicine R. biflorus.

KEYWORDS Tibetan medicine； Rubus biflorus； Quality standard； Rutin； Hyperoside；TLC；HPLC

藏藥懸鉤木始載于《四部醫(yī)典》，為藏醫(yī)常用藥材，藏文譯音為“干扎嘎日”[1]，為薔薇科懸鉤子屬植物粉枝莓（Rubus biflorus Buch.-Ham. ex Smith）的干燥去皮的莖或枝。其分布于我國陜西、甘肅、四川、青海、西藏等地，在印度西北部、克什米爾地區(qū)、巴基斯坦、阿富汗、伊朗等地也有分布[2]?！毒е楸静荨酚涊d：“懸鉤木味甘、苦、微辛，果味甘、酸，用于治隆熱病、培根病、浮腫，治肺病特效，亦治熱性時疫[3]?！睉毅^木藥材被廣泛用于藏藥復方制劑中，如十一味能消散、四味土木香散等[1]，其化學成分主要包括槲皮素、木犀草素、芹菜素、山柰酚、矢車菊素及其糖苷類以及金絲桃苷、蘆丁、粉枝莓素，二萜、三萜以及少數(shù)單萜，沒食子鞣質、逆沒食子鞣質、可水解鞣質低聚體和咖啡鞣質等[4-5]。現(xiàn)代藥理研究表明，懸鉤木具有活血化癖、清熱解毒之功效[6-8]。本研究結合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，從性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）等方面對懸鉤木藥材進行定性鑒別，測定藥材水分、灰分、浸出物的含量，采用高效液相色譜法（HPLC）測定藥材中蘆丁和金絲桃苷的含量，從而建立一個相對完善的質量標準，為保障該藥材質量提供一定依據。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括二元梯度泵、2996紫外檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；UPT-Ⅱ型超純水機（成都優(yōu)普超純水科技有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁對照品（批號：100080-201610，純度：>98%）、金絲桃苷對照品（批號：111521-201507，純度：>98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，甲醇為色譜純和優(yōu)級純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

懸鉤木藥材采集自青海、甘肅和西藏等地（見表1），經中國科學院新疆理化技術研究所多杰教授鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 性狀

藥材樣品呈圓柱形，長約 20 cm，直徑 0.4～0.8 cm。表面灰紅色至灰紅褐色，有縱向皺溝、突起的側枝痕及白色的皮刺基。外皮易剝離，剝離后呈紅褐色。易折斷，斷面不平坦，皮部較薄、呈紅褐色，木部黃白色至淺紅褐色。髓部較大，疏松呈海綿狀，呈白色至黃白色，體輕，質堅硬。氣微，味淡。

2.2 顯微鑒別

藥材樣品粉末呈淺黃色。木纖維成束或單個散在，壁較薄，壁孔不明顯，木射線寬1～3列細胞，射線細胞類方形，壁孔及紋孔明顯。韌皮纖維較粗，兩端稍鈍，胞腔較大。木栓細胞類方形或長方形，黃棕色。草酸鈣簇晶較多，棱角圓鈍或稍尖，大小不等。具緣紋孔導管較大，紋孔較密。顯微特征詳見圖1。

2.3 TLC鑒別

取藥材樣品粉末（過2號篩）1.0 g，加甲醇20 mL，加熱回流60 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取金絲桃苷對照品適量，加甲醇制成金絲桃苷質量濃度為2 mg/mL的對照品溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[9]試驗，吸取上述2種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，避光展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液，晾干，置日光燈下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖2。

2.4 水分測定

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅨH水分測定法的第一法（烘干法）[10]測定其中水分，每批平行測定3份。結果顯示，藥材樣品水分為6.71%～7.55%，平均值為7.13%，詳見表2。初步擬定懸鉤木藥材水分不得過10.0%。

2.5 灰分測定

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅨK灰分測定法[10]測定其中灰分。每批平行測定3份。結果顯示，藥材樣品總灰分為1.43%～1.67%，平均值為1.58%；酸不溶性灰分為0.41%～0.48%，平均值為0.45%，詳見表2。初步擬定懸鉤木藥材總灰分不得過3.0%，酸不溶性灰分不得過0.6%。

2.6 浸出物測定

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅩA浸出物測定法[10]測定其中水浸出物和醇浸出物（乙醇體積分數(shù)為95%），每批平行測定3份。結果顯示，藥材樣品水浸出物為17.70%～19.31%，平均值為18.40%；醇浸出物為13.76%～16.99%，平均值為15.50%，詳見表2。初步擬定懸鉤木藥材水浸出物不得少于15.0%，醇浸出物不得少于12.0%。

2.7 含量測定

2.7.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（18 ∶ 82，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL[11]。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以蘆丁和金絲桃苷峰計均不低于5 000；各成分基線分離良好，分離度大于1.5，詳見圖3。

2.7.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、金絲桃苷對照品各5.0 mg，置于同一100 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖勻，得蘆丁、金絲桃苷質量濃度均為0.05 mg/mL的混合對照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過2號篩）0.500 g，置于100 mL回流圓底燒瓶中，加乙腈25 mL，密塞，稱定質量，70 ℃回流2 h；放冷至室溫，再次稱定質量，用乙腈補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.7.4 線性關系考察 分別精密量取“2.7.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋為原溶液質量濃度的1/2、1/4、1/8、1/16，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述混合對照品原溶液和系列稀釋溶液各10 μL，按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以蘆丁、金絲桃苷質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得蘆丁、金絲桃苷回歸方程分別為y=147 120x+27 634（r=0.999 2）、y=227 953x-1 338 091（r=0.999 5）。結果表明，蘆丁、金絲桃苷檢測質量濃度線性范圍均為3.13～50 μg/mL。

2.7.5 定量限與檢測限考察 分別精密量取“2.7.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定。當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。結果，蘆丁、金絲桃苷的定量限分別為0.5、1.8 μg/mL，檢測限分別為0.2、0.9 μg/mL。

2.7.6 精密度試驗 取“2.7.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.7.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.79%、0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.7.3”項下供試品溶液（編號：XGM-1）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.01%、1.72%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩(wěn)定。

2.7.8 重復性試驗 精密稱取樣品（編號：XGM-1）適量，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，蘆丁、金絲桃苷含量平均值分別為0.930、0.280 mg/g，RSD分別為1.94%、1.06%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.7.9 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（編號：XGM-1）適量，共9份，分別加入高、中、低質量的待測成分對照品，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.7.10 藥材樣品含量測定 取10批藥材樣品各適量，分別按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果顯示，藥材樣品中蘆丁和金絲桃苷總量為1.103～1.331 mg/g，平均值為1.203 mg/g，詳見表2。初步擬定兩者總量不得少于1.0 mg/g。

3 討論

筆者研究了藏藥懸鉤木藥材原標準中的性狀和顯微特征，增加了TLC鑒別，水分、灰分、浸出物與蘆丁、金絲桃苷的含量測定。在TLC預試驗中，筆者考察了不同展開系統(tǒng)，并考察了不同點樣量（1、2、3、4 μL）對展開結果的影響，發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）為展開劑、點樣2 μL時，斑點清晰，效果最佳；另外，還考察了不同溫度、濕度、薄層板對展開結果的影響，發(fā)現(xiàn)各條件對展開結果影響不大。

筆者對收集的10批懸鉤木藥材樣品進行了測定，結果水分為6.71%～7.55%，總灰分為1.43%～1.67%，酸不溶性灰分為0.41%～0.48%，水浸出物為17.70%～19.31%，醇浸出物為13.76%～16.99%，因此，暫定水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、3.0%、0.6%，水和醇浸出物分別不得少于15.0%、12.0%。研究發(fā)現(xiàn)，不同產地懸鉤木藥材中蘆丁和金絲桃苷含量略有差異，結合藥材來源、存放等原因，為保證其臨床療效，暫定蘆丁和金絲桃苷總量不得少于1.0 mg/g。

綜上所述，所建立的標準可用于藏藥懸鉤木的質量控制。

參考文獻

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（收稿日期：2017-04-21 修回日期：2017-07-03）

（編輯：張 靜）