酶解—高壓均質(zhì)制備高溶解性、高消化率豆乳粉工藝

尋崇榮，范志軍，王冬梅，王中江，江連洲，李　楊

(1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱　150030；2 黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，哈爾濱　150036)

高壓均質(zhì)技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于食品工程中。高壓均質(zhì)過程同時(shí)涉及空化、剪切、湍流和溫升等問題。研究表明，高壓均質(zhì)會(huì)影響蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，但對(duì)大多數(shù)的球狀蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小[12]，可與蛋白互補(bǔ)，限制性酶解可在一定程度上改變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[13]及功能特性，如溶解性和乳化能力[14-16]。而有研究表明，高壓均質(zhì)輔助堿性蛋白酶限制性酶解處理大豆球蛋白，可改善其功能特性[17]，此外，高壓均質(zhì)輔助胃蛋白酶酶解大豆分離蛋白，可得到更多的柔性蛋白及可溶性蛋白聚集體，提高大豆分離蛋白的溶解性、乳化性等功能特性[18]。

目前，已有研究報(bào)道了單獨(dú)采用酶解法或高壓均質(zhì)法提高豆乳粉的溶解性，然而采用酶解聯(lián)合高壓均質(zhì)提高豆乳粉溶解性的研究尚未見報(bào)道。本文以傳統(tǒng)濕法加工技術(shù)制備豆乳粉為基礎(chǔ)，利用酶解—高壓均質(zhì)法以改善豆乳粉的溶解性，通過響應(yīng)面優(yōu)化分析法對(duì)酶解—高壓均質(zhì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以改善豆乳粉的溶解性；對(duì)豆粉的粒徑及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為速溶性豆乳粉的生產(chǎn)加工提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

大豆，哈爾濱九三油脂集團(tuán)；大豆磷脂，周口慧洋飼料有限公司；Protex-6L堿性蛋白酶(酶活力1.0×105U/g)，丹麥novo公司；實(shí)驗(yàn)所需基礎(chǔ)試劑均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

1.2　儀器

FDM-Z80豆?jié){機(jī)，上海偉業(yè)儀器廠；FPG12800E.N00實(shí)驗(yàn)型高壓均質(zhì)機(jī)，島津公司；噴霧干燥機(jī)，無錫昂益達(dá)機(jī)；Zetasizer Nano-ZS90光散射粒徑分析儀，英國Malvern公司；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；pHS-25型酸度計(jì)，上海江儀儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；HYP-Ⅱ八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動(dòng)蒸餾器，江蘇省宜興市科教儀器研究所；Olympus U182/U1S光學(xué)顯微鏡，Copyright 奧林巴斯有限公司。

1.3　豆乳粉的制備

大豆→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣混合物→漿渣分離→豆乳→酶解→滅酶→高壓均質(zhì)→調(diào)配→濃縮→噴霧干燥→豆乳粉。參照齊寶坤等[3]的方法稱取50g大豆于燒杯中，用濃度為0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水熱燙5min，按豆水比1∶7的比例添加90℃的去離子水進(jìn)行磨漿得漿渣混合物，然后漿渣分離得豆乳，調(diào)節(jié)豆乳溫度，用0.1mol/L的HCL和NaOH調(diào)節(jié)pH，加入Protex-6L堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后95℃滅酶5min，對(duì)酶解后的豆乳進(jìn)行高壓均質(zhì)處理后，添加2%的乳化劑大豆磷脂進(jìn)行調(diào)配混勻，將調(diào)配好的豆乳進(jìn)行真空濃縮至豆乳固形物含量達(dá)15%左右，然后在進(jìn)口溫度為185℃、出口溫度為85℃條件下進(jìn)行噴霧干燥即得豆乳粉。

1.4　酶解工藝的單因素試驗(yàn)

保持均質(zhì)壓力為150 MPa、均質(zhì)次數(shù)2次、酶解溫度為54℃、酶解時(shí)間為1.5 h、酶解pH為9、酶添加量為1.5%為基礎(chǔ)工藝，分別選取酶解溫度為45、50、55、60、65℃，酶解時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，酶解pH為7、8、9、10、11，酶添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%進(jìn)行單因素試驗(yàn)。通過蛋白質(zhì)分散指數(shù)(%)和蛋白質(zhì)消化率(%)比較分析確定酶解工藝單因素最優(yōu)條件。

1.5　高壓均質(zhì)工藝的單因素試驗(yàn)

保持酶解溫度為54℃、酶解時(shí)間為1.5 h、酶解pH為9、酶添加量為1.5%、均質(zhì)壓力為150 MPa、均質(zhì)次數(shù)2次為基礎(chǔ)工藝。在其他條件不變的情況下，分別選取均質(zhì)壓力為50、100、150、200、250 MPa，均質(zhì)次數(shù)為1、2、3、4、5次，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。通過蛋白質(zhì)分散指數(shù)(%)和蛋白質(zhì)消化率(%)比較分析確定高壓均質(zhì)處理工藝單因素最優(yōu)條件。

1.6　蛋白質(zhì)分散指數(shù)的測定

參照齊寶坤等[3]的方法取一定量豆乳粉樣品以1∶20的料液比分散于去離子水中，充分?jǐn)嚢?0min，待分層后將溶解液于3 000r/min下離心10min，離心后取上清液測定蛋白含量(凱氏定氮法)。計(jì)算公式如式(1)：

(1)

1.7　體外模擬胃腸道消化試驗(yàn)

參照夏明敬[5]的方法，稱取2g豆粉溶于100mL去離子水中，在37℃的浴鍋中預(yù)熱10min。用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為3.0，加入50U/g的胃蛋白酶和75U/g的凝乳酶不斷攪拌水解1h后用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0。然后加入1 000U/g的胰蛋白酶，不斷攪拌2h，到時(shí)間后經(jīng)沸水浴滅活5min。取10mL消化好的樣品，加入等體積的10%的三氯乙酸沉淀蛋白，然后在4 000r/min條件下離心10min。取上清液，釆用凱氏定氮法測定可溶性蛋白的含量。蛋白質(zhì)白化率計(jì)算公式如式(2)：

(2)

1.8　豆粉乳液的粒徑分布

用Zetasizer Nano-ZS 90光散射粒度分析儀分別測定傳統(tǒng)濕法制備、最佳酶解及最佳酶解—高壓均質(zhì)工藝制備的豆粉乳液的粒徑分布規(guī)律，樣品折射率設(shè)置為1.5，溶液折射率設(shè)置為1.33。為了降低多重光散射效應(yīng)，分析前用去離子水稀釋豆乳粉5 000倍測粒徑。

1.9　豆乳粉的光學(xué)顯微鏡觀察

通過光學(xué)顯微鏡分別對(duì)傳統(tǒng)濕法工藝、最佳酶解工藝、最佳高壓均質(zhì)工藝及最佳酶解—高壓均質(zhì)工藝噴霧干燥后的豆乳粉進(jìn)行觀察。分別用去離子水將上述豆乳粉稀釋10倍后，經(jīng)旋渦混合器震蕩10s，吸取混合后的豆粉乳液于載玻片上，蓋上載玻片后進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.10　數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)都進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，并進(jìn)行誤差分析。采用SPASS 18對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性和差異顯著性分析；采用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖；采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析及方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　酶解工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響由圖1可知，當(dāng)酶解溫度從45℃升高到55℃時(shí)，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率隨溫度的升高而顯著增加(P<0.05)，酶解溫度為55℃時(shí)，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率達(dá)到最大；繼續(xù)升高酶解溫度，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率均有降低趨勢(shì)。該結(jié)果與齊寶坤等[3]、田杰等[24]的研究結(jié)果一致，即酶解可提高大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)分散指數(shù)和體外消化率，但溫度低于或高于最適酶解溫度時(shí)會(huì)降低蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率。原因是Protex-6L堿性蛋白酶的最適酶解溫度在55℃左右，在該酶解溫度范圍內(nèi)酶解效果較好，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠摐囟葧r(shí)會(huì)降低Protex-6L堿性蛋白酶的催化活性，降低蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率。說明適度的酶解利于人體吸收利用，改善豆乳粉的營養(yǎng)價(jià)值。綜合考慮，選擇酶解溫度為55℃。

2.1.2酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響由圖2可知，當(dāng)酶解時(shí)間由0.5h增加到1.5h時(shí)，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率隨著酶解時(shí)間的增加而顯著性增加(P<0.05)，而超過1.5h后繼續(xù)增加酶解時(shí)間，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率變化不明顯。原因是酶解初期底物相對(duì)含量較高，酶與底物接觸充分，利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，提高豆乳粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率；但隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長，底物相對(duì)含量不斷減少，產(chǎn)物相對(duì)含量增加，酶解產(chǎn)物與底物產(chǎn)生競爭性抑制，酶促反應(yīng)達(dá)到平衡，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率變化不明顯[22，24]。綜合考慮，選擇酶解時(shí)間為1.5 h。

2.1.3酶解pH對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響由圖3可知，當(dāng)酶解pH從7.0升高到9.0時(shí)，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率隨溫度的升高而顯著增加(P<0.05)，酶解pH為9.0時(shí)，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率達(dá)到最大；繼續(xù)升高酶解pH，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率均有降低趨勢(shì)。原因是Protex-6L堿性蛋白酶的最適酶解pH在9.0左右，在該酶解pH時(shí)酶解效果較好，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠損H時(shí)會(huì)改變酶分子構(gòu)象，降低Protex-6L堿性蛋白酶的催化活性，抑制酶促反應(yīng)，從而降低蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率[15，24]。綜合考慮，選擇酶解pH為9。

2.1.4酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響由圖4可知，當(dāng)酶添加量從0.5%升高到1.5%時(shí)，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率隨著酶添加量的增加而顯著增加(P<0.05)，當(dāng)加酶量達(dá)到1.5%時(shí)，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率達(dá)到最大；繼續(xù)增加酶添加量，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率有下降趨勢(shì)。原因是相對(duì)底物含量的限制及酶分子之間相互碰撞減少了底物與酶碰撞機(jī)會(huì)，降低酶促效應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率下降，這與徐錦麗[23]的研究結(jié)果一致，即適度增加酶添加量可改善大豆蛋白的溶解性及消化利用率。綜合考慮，確定酶添加量為1.5%。

圖1　酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響

圖2　酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響

圖3　酶解pH對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響

圖4　酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白質(zhì)消化率的影響

2.2　高壓均質(zhì)工藝單因素確定試驗(yàn)

由圖5可知，當(dāng)均質(zhì)壓力從50MPa升高到150MPa時(shí)，豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白消化率隨著均質(zhì)壓力的增加而顯著增加(P<0.05)。這是由于豆乳中的蛋白、油滴等相互聚集的大顆粒在高壓均質(zhì)的高速剪切作用下均勻分散，降低大分子之間的纏繞作用，使豆乳的表觀黏度下降，促進(jìn)蛋白質(zhì)的水化作用，使其溶解度增大[20]。而在高壓均質(zhì)的高速剪切作用下大豆蛋白的剛性結(jié)構(gòu)逐漸展開，柔性增加，暴露出更多的極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)，蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷分布加強(qiáng)，也提高了蛋白質(zhì)的水化作用及乳化作用，以致蛋白質(zhì)分散指數(shù)提高，豆粉粒徑可能減小，促進(jìn)蛋白的消化吸收[20]。綜合考慮，選擇均質(zhì)壓力為150MPa。

由圖6可知，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)對(duì)豆粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)及蛋白消化率的影響不顯著時(shí)(P>0.05)，說明增加均質(zhì)次數(shù)對(duì)豆粉的品質(zhì)影響不大。綜合考慮蛋白質(zhì)分散指數(shù)、表觀粘度的變化及加工成本，選擇均質(zhì)次數(shù)為2次。

2.3　豆粉乳液粒徑的對(duì)比分析

由圖7可知，與傳統(tǒng)濕法工藝相比，經(jīng)酶解及酶解—高壓均質(zhì)工藝制備的豆粉乳液粒徑減小且經(jīng)酶解—高壓均質(zhì)工藝制備的豆粉乳液只有1個(gè)單峰，粒徑最小，粒徑分布范圍最窄。原因可能是酶解使蛋白降解為小分子肽，暴露出更多的疏水基團(tuán)，蛋白分子由球狀剛性結(jié)構(gòu)伸展為柔性結(jié)構(gòu)，提高了蛋白的界面活性，降低油水界面的張力，在乳化過程中形成粒徑細(xì)小的乳液滴，經(jīng)噴霧干燥得到較小粒徑的豆乳粉，豆粉乳液粒徑減小；而高壓均質(zhì)的強(qiáng)剪切力、撞擊、空穴效應(yīng)可進(jìn)一步改善蛋白的表面疏水性、界面活性及乳化性，使酶解后的豆粉乳液更加分散，粒徑減小、分布均一[21，25]。而粒徑對(duì)豆粉的溶解性和豆粉乳液的表觀粘度有重要影響。由斯托克斯定律知，液滴移動(dòng)速度與其半徑平方成正比，因此豆粉乳液的溶解性及表觀粘度可能與液滴粒徑有關(guān)，粒徑越小，豆粉乳液的溶解性越強(qiáng)[26-27]。

2.4　豆粉溶液的顯微觀察

由圖8可知，傳統(tǒng)濕法工藝制備的豆乳粉經(jīng)溶解混合后，顯微圖像顯示出部分乳液液滴聚集，豆乳顆粒分布不均勻；相比較傳統(tǒng)濕法工藝，經(jīng)酶解工藝制備的豆粉乳液液滴聚集較少，豆乳顆粒分布較均勻，粒徑較小；而酶解—高壓均質(zhì)工藝制備的豆粉乳液粒徑最小，豆乳顆粒均勻分布且沒有乳液液滴聚集現(xiàn)象。進(jìn)一步說明酶解可改善豆乳粉的溶解性，而高壓均質(zhì)處理對(duì)酶解有輔助效果，可提高蛋白的乳化性及表面活性以進(jìn)一步提高豆乳粉的溶解性及分散性。

圖5　均質(zhì)壓力對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白消化率的影響

圖6　均質(zhì)次數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)分散指數(shù)和蛋白消化率的影響

圖7　不同豆粉乳液的粒徑分布

圖8　100倍物鏡下不同豆乳粉溶液的顯微圖像

3　結(jié)論

本文對(duì)高壓均質(zhì)輔助酶解制備高溶解性豆乳粉工藝進(jìn)行研究，分別采用離心法、體外模擬胃腸道消化、光散射粒度分析儀及光學(xué)顯微鏡測定豆乳粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)、蛋白質(zhì)消化率，分析豆粉粒徑分布及顯微觀察。單因素試驗(yàn)表明，均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、酶添加量對(duì)豆乳粉蛋白質(zhì)分散指數(shù)具有顯著影響。與未經(jīng)均質(zhì)及酶解處理的傳統(tǒng)豆乳粉(蛋白質(zhì)分散指數(shù)為79.16%[3])相比，高壓均質(zhì)輔助酶解工藝顯著提高了豆乳粉的溶解性及蛋白質(zhì)消化率，減小了豆粉平均粒徑，其蛋白質(zhì)分散指數(shù)提高了近14%?！?/p>