麥胚凝集素修飾的長春瑞濱陽離子脂質(zhì)體的處方優(yōu)選及細(xì)胞毒性試驗(yàn)

肖瑤 王鑫 符敏 劉晶晶 李學(xué)濤 程嵐

中圖分類號 R943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0611-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.09

摘 要 目的：制備麥胚凝集素（WGA）修飾的長春瑞濱（VRB）陽離子脂質(zhì)體（WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體），優(yōu)化處方并進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。方法：以磷脂、膽固醇為輔料，以3β-[N-（N′ -N′ -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽（DC-Chol）為陽離子材料，以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）為長循環(huán)鏈，采用薄膜分散法及硫酸銨梯度法制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體。以包封率為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化處方中DC-Chol、膽固醇和VRB用量。測定所制VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體中VRB含量，比較二者和空白陽離子脂質(zhì)體作用于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549后對細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果：5 mL WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為磷脂22 mg、膽固醇12 mg、DC-Chol 8 mg、VRB 0.5 mg，其包封率為（92.24±1.21）%（n=3），與預(yù)測值的相對誤差為5.3%。VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體中VRB含量分別為（96.01± 3.26）、（93.39±1.59） μg/mL（n=3）；與空白陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體比較，WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體可明顯降低MCF-7、A549細(xì)胞的存活率（P<0.05）。結(jié)論：成功制得WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體，其對MCF-7、A549細(xì)胞存活的抑制作用強(qiáng)于VRB脂質(zhì)體。

關(guān)鍵詞 麥胚凝集素；長春瑞濱；陽離子脂質(zhì)體；處方優(yōu)選；星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Wheat germ agglutinin （WGA） modified vinorelbine （VRB） cationic liposomes （WGA-VRB cationic liposomes）， and to optimize the formulation and conduct cytotoxicity test. METHODS： Thin-film diffusion and ammonium sulfate gradient method were used to prepare WGA-VRB cationic liposomes using phospholipid and cholesterol as excipient， 3β-[N-（N′ -N′ -dimethyl aminoethane）-carbamoyl] cholesterol hydrochloride （DC-Chol） as cationic material， distearoyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol 2000 （DSPE-PEG2000） as long cycle chain. Using encapsulation rate as index， central composite design-response surface methodology was used to optimize the amount of DC-Chol， cholesterol and VRB. The contents of VRB in VRB liposomes and WGA-VRB cationic liposomes were determined. The effects of them and blank cationic liposomes on survival rates of human breast cancer cell MCF-7 and human non-small cell lung cancer cells A549 were compared. RESULTS： The optimal formulation of 5 mL WGA-VRB cationic liposomes was as follows as phospholipid 22 mg， cholesterol 12 mg， DC-Chol 8 mg， VRB 0.5 mg. Encapsulation rate of the liposomes was （92.24±1.21）%（n=3）， relative error of which to predicted value was 5.3%. The contents of VRB in VRB liposomes and WGA-VRB cationic liposomes were （96.01±3.26），（93.39±1.59） μg/mL（n=3）. Compared with blank cationic liposomes and VRB liposomes， WGA-VRB cationic liposomes could significantly reduce survival rate of MCF-7 and A549. CONCLUSIONS： WGA-VRB cationic liposomes are prepared successfully. Inhibitory effect of WGA-VRB cationic liposomes on MCF-7 and A549 cell survival is stronger than that of VRB liposomes.

KEYWORDS Wheat germ agglutinin； Vinorelbine； Cationic liposomes； Formulation optimization； Central composite design- response surface methodology； Content determination

麥胚凝集素（WGA）是從小麥胚芽中提取的一種能與專一性糖結(jié)合、促進(jìn)細(xì)胞凝集的二聚體蛋白質(zhì)。研究表明將其與藥物或載體結(jié)合，可借助凝集素對癌細(xì)胞的親和作用增強(qiáng)抗癌活性[1]。脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層組成的類生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，有降低藥物不良反應(yīng)、提高藥物體內(nèi)靶向性的優(yōu)點(diǎn)[2]。但普通脂質(zhì)體體內(nèi)循環(huán)周期短、主動靶向性弱，限制了脂質(zhì)體的進(jìn)一步應(yīng)用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞膜表面通常帶有較多的負(fù)電荷[5]。陽離子脂質(zhì)體是利用陽離子磷脂材料制備成表面帶有正電荷的靶向給藥制劑[6]，陽離子脂質(zhì)體可通過與腫瘤細(xì)胞膜的靜電吸附作用提高藥物的主動靶向效果。長春瑞濱為人工半合成類生物堿，廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌、食管癌等研究[7]。本課題制備WGA修飾的長春瑞濱（VRB）陽離子脂質(zhì)體（WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體），通過凝集素與腫瘤細(xì)胞的主動親和作用[8]以及陽離子脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞膜的靜電吸附作用來增強(qiáng)VRB對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體處方，測定脂質(zhì)體中VRB的含量并比較VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549存活率的影響。

1 材料

1.1 儀器

FA1004電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技公司）；PHS-25pH計（上海精密科學(xué)儀器公司）；20AT液相色譜儀與紫外檢測器（日本島津公司）；WJ-80B-Ⅱ二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；HBS-1096A酶標(biāo)分析儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

WGA蛋白（瑞典Medicago公司，批號：050102100，含量：>98%）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000，上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司）； VRB原料藥、VRB對照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MB20886、MB5301，純度：>98%、≥98%）；葡聚糖凝膠Sephadex G-50（北京索萊寶科技有限公司）；卵磷脂（日本NOF公司）；膽固醇（普邁生物科技公司）； 3β-[N-（N′ -N′ -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽（DC-Chol，美國Avanti公司）；胎牛血清（FBS）和RPMI-1640培養(yǎng)液（北京邁晨科技有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（無錫耐思生物科技有限公司）；甲醇、氯仿、三乙胺、磷酸等均為分析純。

1.3 細(xì)胞

MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體的制備

以磷脂、膽固醇為輔料，以DC-Chol為陽離子材料，以DSPE-PEG2000為長循環(huán)鏈，采用薄膜分散法和硫酸銨梯度法制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體。取處方量磷脂、膽固醇、DC-Chol、DSPE-PEG2000，加氯仿溶解，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成均勻脂膜，加入250 mol/L （NH4）2SO4水溶液5 mL，超聲水化（功率180 W），然后超聲10 min（超聲時間與間歇時間各10 s，功率200 W），過0.22 μm微孔濾膜2次，過膜后密封于透析膜袋中（截留分子量12 000～14 000 Da），以磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH為7.2～7.4）為透析介質(zhì)，透析3次，每次8 h，加入WGA 2 mg，室溫勻速攪拌2 h，得空白陽離子脂質(zhì)體?？瞻钻栯x子脂質(zhì)體中加入處方量的VRB原料藥，40 ℃水浴振搖20 min，即得。

2.2 VRB的含量測定

2.2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[9]，色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.06 mol/L KH2PO4（0.3%三乙胺）（33 ∶ 67，V/V，磷酸調(diào)pH=4.0）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：267 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 溶液的制備 取WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇破乳定容，制成供試品溶液。取VRB對照品適量，甲醇溶解稀釋制成質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為對照品溶液。取空白陽離子脂質(zhì)體1 mL，置于10 mL量瓶，甲醇定容，作為空白溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液、對照品溶液（0.1 mg/mL）及空白溶液各20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果顯示，VRB的出峰時間為7.9～8.1 min，空白溶液在此無色譜峰出現(xiàn)，可見空白脂質(zhì)體對VRB的測定無干擾。理論板數(shù)按VRB峰計不低于3 000。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測定“2.2.2”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸分析。得回歸方程為y=2 068.1x+31 671（r=0.999 9，n=6），結(jié)果表明，VRB檢測質(zhì)量濃度在12.5～400 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)5次，計算峰面積的RSD為1.27%（n=5），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算峰面積的RSD為1.62%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取空白陽離子脂質(zhì)體1 mL，于10 mL量瓶，加0.1 mg/mL VRB對照品溶液1 mL，甲醇定容制成質(zhì)控樣品溶液，重復(fù)6次，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算平均加樣回收率為99.00%（RSD為1.10%，n=6）。

2.3 包封率的測定

取Sephadex G-50 2.0 g，于PBS中浸泡24 h，濕法裝柱（10 cm×1.5 cm）備用。取WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體0.5 mL，置于凝膠柱上方，以1.0 mL/min流速用PBS洗脫，收集乳光部分加PBS定容混勻。取WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體0.5 mL，加PBS定容至相同體積混勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)3次，計算包封率（%）=（W后/W前）×100%，式中W后和W前分別為過柱后和過柱前脂質(zhì)體中VRB的含量。

2.4 優(yōu)化脂質(zhì)體處方

根據(jù)單因素考察結(jié)果和文獻(xiàn)[10]，依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法設(shè)計原理選擇對陽離子脂質(zhì)體包封率影響較大的3個因素即DC-Chol用量（X1）、膽固醇用量（X2）、VRB用量（X3）為因素，以包封率（Y）為指標(biāo)，固定處方量為5 mL、磷脂為22 mg，確定各因素的用量范圍為：X1 4～12 mg，X2 4～12 mg，X3 0.2～0.6 mg，并分別設(shè)立3個水平設(shè)計試驗(yàn)。因素與水平見表1，星點(diǎn)設(shè)計與結(jié)果見表2。

將表2中數(shù)據(jù)輸入Design-Expert 8.0.6.1軟件，擬合方程為Y=21.320 0-2.266 9X1+18.973 8X2-178.037 5X3+0.426 6X1X2+1.118 8X1X3+10.475 0X2X3-0.131 9X12-1.178 4X22+62.250 0X32（R=0.970 3，P<0.05），說明模型能夠很好地反映響應(yīng)值的變化，可用于分析和預(yù)測WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體的最優(yōu)處方。對上述擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，X2和X22對Y有顯著影響（P<0.01）；X1、X3、X1X2、X2X3、X1X3對Y沒有顯著影響（P>0.05）。固定一個因素的水平為0，使用Design-Expert 8.0.6.1軟件生成其他因素對包封率的響應(yīng)面圖和等高線圖，響應(yīng)面圖見圖1，等高線圖見圖2。

從圖1和圖2可以看出，3個因素間沒有明顯的交互作用，在磷脂固定不變的情況下X1和X3對Y的影響不大，但X2對Y有顯著影響。因此結(jié)合實(shí)驗(yàn)室脂質(zhì)體處方考察經(jīng)驗(yàn)及脂質(zhì)體制備的實(shí)際要求和脂質(zhì)體性狀，確定最優(yōu)處方為磷脂22 mg、DC-Chol 8 mg、膽固醇12 mg、VRB 0.5 mg，處方量為5 mL。根據(jù)最優(yōu)處方制備3批WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體，測定包封率。結(jié)果顯示，3批樣品的包封率為（92.24±1.21）%，其與預(yù)測值（87.56%）的相對誤差為5.3%。表明該處方合理，方法可行。

2.5 脂質(zhì)體中VRB的含量比較

2.5.1 脂質(zhì)體的制備 按最優(yōu)處方，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下方法制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體，同法制備，不含DC- Chol和WGA的VRB脂質(zhì)體。

2.5.2 VRB的含量測定 分別測定WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體中VRB的含量，各3批。結(jié)果顯示，WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體中VRB的含量分別為（93.39±1.59）、（96.01±3.26） μg/mL（n=3）。

2.6 脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%FBS、100 ?g/mL青-鏈霉素）培養(yǎng)液中，于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6.2 細(xì)胞存活率的測定 收集對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞（約2×104個/孔）接種于96孔培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入0（空白對照）、0.011、0.027、0.043、0.059、0.076、0.092、0.110 ?g/mL WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體或VRB脂質(zhì)體，以空白陽離子脂質(zhì)體為對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用SRB法[11]測定細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=藥物處理后的光密度值/空白對照的光密度值×100%。結(jié)果顯示，與空白陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體比較，WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體作用后細(xì)胞的存活率明顯降低（P<0.05）。3種脂質(zhì)體作用后MCF-7、A549細(xì)胞存活率結(jié)果見圖3。

3 討論

星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法是目前常用的將數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)相融合的試驗(yàn)設(shè)計方法，將星點(diǎn)設(shè)計應(yīng)用于脂質(zhì)體處方優(yōu)選的研究也不斷增多。脂質(zhì)體研究中常常將膜材用量比例作為研究指標(biāo)，本試驗(yàn)在傳統(tǒng)脂質(zhì)體處方基礎(chǔ)上，固定磷脂量，以膽固醇、DC-Chol、VRB用量為因素，脂質(zhì)體包封率為指標(biāo)優(yōu)化了脂質(zhì)體處方，最終確定制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體（5 mL）的最優(yōu)處方為磷脂22 mg、DC-Chol 8 mg、膽固醇12 mg、VRB 0.5 mg。2015年版《中國藥典》有關(guān)脂質(zhì)體包封率的要求為80%以上[12]，經(jīng)驗(yàn)證該陽離子脂質(zhì)體最終處方的平均包封率為（92.24±1.21）%（n=3）。結(jié)果表明，該陽離子脂質(zhì)體處方符合要求，并為該陽離子脂質(zhì)體的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

VRB對腫瘤有較好的臨床治療效果，因毒副作用大，常將其制備成靶向制劑。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇組成的類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，因其具有可與細(xì)胞膜融合、體內(nèi)可降解的特點(diǎn)被廣泛用于靶向給藥系統(tǒng)。脂質(zhì)體作為一種安全穩(wěn)定的載體形式，多用于基因靶向治療的研究中[13]。本課題在此基礎(chǔ)上引入陽離子材料，利用藥物與細(xì)胞膜表面負(fù)電荷的靜電吸附作用，增加其靶向性效果[14]。WGA可與腫瘤細(xì)胞表面的特定受體相結(jié)合，因此引入WGA修飾于脂質(zhì)體表面。最終制備了理論上具有雙重靶向治療作用的WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體。通過細(xì)胞存活率的比較，評價了VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體對MCF-7、A549細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體對MCF-7、A549細(xì)胞存活的抑制作用強(qiáng)于VRB脂質(zhì)體。

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（收稿日期：2017-08-29 修回日期：2017-11-09）

（編輯：鄒麗娟）