超微粉碎技術(shù)對(duì)靈芝中三萜類成分溶出的影響

張福君 瞿晶田 王強(qiáng)

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）05-0599-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.06

摘 要 目的：研究超微粉碎技術(shù)對(duì)靈芝中三萜類成分溶出的影響。方法：采用紫外-可見分光光度法測(cè)定靈芝中三萜類成分總提取率，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定靈芝中9種三萜類成分（靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H）含量，比較30、50、80目靈芝普通粉和300目靈芝超微粉中三萜類成分總提取率及9種三萜類成分的含量。結(jié)果：30、50、80、300目靈芝粉中三萜類成分總提取率分別為（0.74±0.08）%、（0.75±0.06）%、（0.78±0.06）%、（1.09±0.10）%（RSD<2%，n=3）；隨著靈芝粉目數(shù)的增大，三萜類成分含量逐漸增大，其中300目含量最大，顯著高于靈芝普通粉（P<0.05）。結(jié)論：靈芝經(jīng)超微粉碎后三萜類成分的溶出增加。

關(guān)鍵詞 靈芝；超微粉碎技術(shù)；三萜類成分；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of ultrafine grinding technology on the dissolution of triterpenoids from Ganoderma lucidum. METHODS： UV spectrophotometry was used to determine total extration rates of triterpenoids from G. lucidum. HPLC method was used to determine the contents of 9 kinds of triterpenoids （ganoderic acid A， ganoderic acid B， ganoderic acid C， ganoderic acid C1， ganoderic acid C2， ganoderic acid D， ganoderic acid E， ganoderic acid G， ganoderic acid H） from G. lucidum. The total extration rates and the contents of 9 kinds of triterpenoids were compared between 30， 50， 80 mesh common G. lucidum powder and 300 mesh G. lucidum ultramicro powder. RESULTS： The total extraction rates of triterpenoids from 30， 50， 80， 300 mesh G. lucidum powder were （0.74±0.08）%， （0.75±0.06）%， （0.78±0.06）%， （1.09±0.10）% （RSD<2%，n=3）， respectively. With the increase of the mesh number of G. lucidum powder， the contents of triterpenoids were increased gradually， and were the highest in 300 mesh， which was significant higher than common G. lucidum powder （P<0.05）. CONCLUSIONS： After ultrafine grinding， the dissolution of triterpenoids from G. lucidum is increased.

KEYWORDS Ganoderma lucidum； Ultrafine grinding technology； Triterpenoids； HPLC

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔(dān)子菌類多孔菌科靈芝屬真菌，有紅色、黃色、白色和紫色等[1]。我國(guó)魯、云、貴、吉、浙、蘇、閩等省份分布著赤靈芝、紫靈芝、薄蓋靈芝等20多種靈芝，其中以泰山赤靈芝最為出名[2]。在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，靈芝應(yīng)用由來(lái)已久，具有寧心安神、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的功能，廣泛治療高血壓、高血脂、慢性肝炎、慢性腎炎、關(guān)節(jié)炎、失眠癥、神經(jīng)衰弱、支氣管炎、胃潰瘍、氣喘病、動(dòng)脈硬化、糖尿病、白細(xì)胞減少癥、厭食、蘑菇中毒、病后身體虛弱等癥[3]。

超微粉碎技術(shù)是指利用超細(xì)化的機(jī)械加工手段使粉體克服固體內(nèi)部凝聚力使之粉碎至10～25 μm的操作技術(shù)。早在20世紀(jì)90年代，我國(guó)中藥行業(yè)就引入了超微粉碎技術(shù)，近年來(lái)該技術(shù)發(fā)展迅速。超微粉碎技術(shù)可顯著增加中藥溶出量和溶出率，提高有效成分生物利用度和溶出量[4]。本文研究了靈芝經(jīng)超微粉碎后對(duì)其中主要成分三萜類成分（靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H）溶出的影響，旨在為靈芝中的進(jìn)一步開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Q65-1CN電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Mastersizer 2000激光粒度分析儀（英國(guó)Malvern公司）；SYFM-8 Ⅱ超微粉碎機(jī)（濟(jì)南天方機(jī)械有限公司）；UV-9600紫外分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；1200 高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 藥材與試劑

靈芝（批號(hào)：151106）購(gòu)自河北安國(guó)市伊康藥業(yè)有限公司，由天津中醫(yī)藥大學(xué)王傳福教授鑒定為擔(dān)子菌類多孔菌科靈芝；齊墩果酸、靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H對(duì)照品（批號(hào)：111985-201601、10356、1230-5026、35105、4150-896、12538、465601、236110、10233-365、107892）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度：均≥99%；甲醇、乙酸乙酯、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 靈芝普通粉和超微粉的制備

靈芝普通粉：取適量靈芝藥材常規(guī)粉碎，分別過(guò)30、50、80目篩，收集各組藥材粉末。靈芝超微粉：先將靈芝藥材粗粉碎，干燥至水分約為5%，經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎45 min，經(jīng)激光粒度儀測(cè)定90%粒徑分布[d（90）]<25 μm，過(guò)300目篩，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H對(duì)照品各5 mg于10 mL量瓶中，甲醇溶解、定容，量取1 mL轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，甲醇定容，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取靈芝普通粉和超微粉樣品各1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，超聲（80 Hz，60 W）提取30 min，過(guò)濾、蒸干至無(wú)醇味，加甲醇轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容。

2.3 三萜類成分總提取率比較

按照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）靈芝項(xiàng)下三萜甾醇含量測(cè)定法測(cè)定三萜總提取率，三萜總提取率（%）=三萜總提取量/藥材質(zhì)量×100%。精密量取齊墩果酸對(duì)照品或供試品溶液置于15 mL具塞試管中，揮干，冷卻，精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min后，立即冰浴5 min，加入乙酸乙酯4 mL。紫外-可見分光光度法于546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以齊墩果酸含量計(jì)算三萜類成分總提取率。結(jié)果，30、50、80目靈芝普通粉和300目靈芝超微粉三萜類成分總提取率分別為（0.74±0.08）%、（0.75±0.06）%、（0.78±0.06）%、（1.09±0.10）%（RSD<2%，n=3），300目靈芝超微粉中三萜類成分總提取率顯著高于靈芝普通粉（P<0.05）。

2.4 9種三萜類成分的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 色譜柱：Agilent XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，26%～29%A；30～58 min，29%～35%A；58～73 min，35%～38%A）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm；進(jìn)樣量：20 μL。該色譜條件下，取“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各個(gè)峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系與定量限考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容后搖勻，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.4.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各成分峰面積RSD以考察精密度；取供試品溶液，分別在0、2、4、8、16 、24 h時(shí)，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各成分峰面積RSD以考察穩(wěn)定性；取300目靈芝粉末6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制成供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算各成分峰面積RSD以考察重復(fù)性。精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H峰面積的RSD均不大于2%（n=6），表明本方法精密度、重復(fù)性良好，24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的300目靈芝粉末3份，分別精密加入9種混合對(duì)照品溶液1.5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制成供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分回收率。結(jié)果，靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H的回收率為98.11%～103.83%（RSD≤1.56%，n=3），符合相關(guān)要求，結(jié)果見表3。

2.4.5 樣品含量測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下靈芝普通粉與靈芝超微粉各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，隨著靈芝粉目數(shù)的增大，靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H含量逐漸增大，其中300目含量最大，結(jié)果見表4。

3 討論

超微粉碎技術(shù)是一種將固體材料粉碎成10～25 μm粉體的技術(shù)，在食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。目前常用的粉碎機(jī)有振動(dòng)超細(xì)粉碎機(jī)、氣流粉碎器、研磨剪切超細(xì)粉碎機(jī)、高速攪拌研磨機(jī)等[4-6]。超微粉碎技術(shù)在中藥材領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸受到重視，該技術(shù)不僅粉碎速度快，粉末粒度小而均勻，而且藥材細(xì)胞破壁率高，有利于提高有效成分的溶出率[7]。

三萜類化合物是靈芝的主要有效成分之一，目前在靈芝中已知的三萜類化合物已有100多種，既往研究顯示，靈芝三萜具有抗人類免疫缺陷病毒（HIV）、護(hù)肝、抗高血壓、抑制組胺釋放、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[8-10]。而三萜類成分的提取率直接關(guān)系到靈芝藥效的發(fā)揮。本研究建立了靈芝中9種三萜類成分的HPLC分析方法，經(jīng)精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)等考察，該方法全部達(dá)標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，30、50、80目靈芝普通粉和300目靈芝超微粉三萜類成分總提取率分別為（0.74±0.08）%、（0.75±0.06）%、（0.78±0.06）%、（1.09±0.10）%，300目靈芝超微粉三萜類成分總提取率顯著高于靈芝普通粉（P<0.05），表明超微粉碎技術(shù)有助于靈芝三萜類成分的溶出。

目前，超微粉碎技術(shù)能促進(jìn)中藥材中有效成分的溶出已得到廣泛證實(shí)。如何春龍等[11]報(bào)道稱，通過(guò)采用靈芝超微粉和普通粉的三萜類成分指紋圖譜分析方法，發(fā)現(xiàn)靈芝藥材經(jīng)過(guò)超微粉碎后三萜類成分種類沒(méi)有改變，但單含量提高，認(rèn)為該技術(shù)能有效促進(jìn)靈芝三萜類成分的溶出，與本研究結(jié)果一致。吳長(zhǎng)輝[12]報(bào)道稱，采用超微粉碎技術(shù)將靈芝粉碎成300 目粉體，可大幅提高靈芝總多糖的提出率和溶出速度。黃建城[13]報(bào)道稱，采用超微粉碎技術(shù)粉碎靈芝能明顯提高靈芝多糖提取率。這主要是由于超微粉碎技術(shù)一方面提高了藥材細(xì)胞的破壁率，有助于有效成分的溶出，另一方面超微粉具有很強(qiáng)的表面親和性、吸附性和溶解性，可提高有效成分釋放速率[14-15]。因此，超微粉碎技術(shù)在中藥提取中具有極大的優(yōu)勢(shì)，可以提高中藥中有效成分的溶出和臨床藥效，適合溶出度較低的中藥制劑的生產(chǎn)，有利于減少藥材用量、節(jié)約成本。

綜上所述，靈芝經(jīng)超微粉碎后，有助于靈芝三萜類成分的溶出，降低其臨床使用量，從而節(jié)約藥材用量。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 李國(guó)華，李曄，梅錫玲，等.靈芝三萜類化合物研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（12）：1858-1862.

[ 2 ] 賈紅巖，王亞濤，張芝華，等.高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地及品種靈芝三萜類成分的含量[J].微生物學(xué)通報(bào)，2017，44（1）：238-244.

[ 3 ] 李保明，古海鋒，李曄，等. HPLC 測(cè)定不同產(chǎn)地靈芝中 9 種三萜酸[J].中國(guó)中藥雜志，2012，36 （23）：3599-3603.

[ 4 ] 吳會(huì)清.靈芝多糖對(duì) S180 荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子水平與臟器指數(shù)的影響[J].中國(guó)藥房，2014，25（35）：3273- 3275.

[ 5 ] XU ZK，GAO J，QIN JP，et al. Research on ultrafine grinding technology of improving dissolution rates of effective components in Sanjie Zhentong capsule[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2015，40（10）：1945-1947.

[ 6 ] 張靜，李佳偉，張永靜.超微粉碎技術(shù)在中藥中的研究進(jìn)展[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，16（5）：150-153.

[ 7 ] 丁圣清，郁省，王冬東，等.中藥飲片超微粉碎實(shí)現(xiàn)劑型改革的初步試驗(yàn)[J].中國(guó)藥業(yè)，2016，25（23）：38-42.

[ 8 ] 李鵬，魏曉霞，南婷婷，等.靈芝三萜酸對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（23）：1914- 1918.

[ 9 ] HA DO T，LOAN LE T，HUNG TM，et al. An improved HPLC-DAD method for quantitative comparisons of triterpenes in ganoderma lucidum and its five related species originating from vietnam[J]. Molecules，2015，20（1）：1059-1077.

[10] 李守信，邱新建，賀鳳成，等.紅參超微粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2014，25（3）：256-259.

[11] 何春龍，張屏，鞠愛華，等.靈芝超微粉，普通粉和靈芝提取物高效液相色譜指紋圖譜的比較研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32 （2）：575-578.

[12] 吳長(zhǎng)輝.超微粉碎對(duì)靈芝中多糖、三萜的影響[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2015（8）：18-23.

[13] 黃建城.膜分離及超微粉碎技術(shù)在靈芝制劑中的應(yīng)用研究[D].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2008.

[14] 孫源源，杜光.超微粉碎技術(shù)在中藥中的應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33（1）：69-71.

[15] 賈海玲，王健，張萍，等.河北省精神衛(wèi)生機(jī)構(gòu)老年抑郁癥患者藥物使用的調(diào)查分析[J].中國(guó)藥房，2017，28（21）：2895-2898.

（收稿日期：2017-07-04 修回日期：2017-12-26）

（編輯：劉明偉）