炙甘草湯對(duì)慢性疲勞綜合征大鼠行為和4種白介素水平的影響

劉偉成，黎杰軒，郭永寧，胡　蘭，劉鴻杰，蔡海榮

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2.佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000)

慢性疲勞綜合征(Chronic fatigue syndrome，CFS)是一種包括慢性反復(fù)發(fā)作的體力疲勞和腦力疲勞等為主要表現(xiàn)的臨床癥候群[1-2]。慢性疲勞綜合征是一種介于疾病和健康之間的一種亞健康狀態(tài)，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[3]。有研究表明，免疫系統(tǒng)中的白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素12(interleukin-12，IL-12)等炎癥因子參與了慢性疲勞綜合征的發(fā)生和發(fā)展[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)慢性疲勞綜合征缺乏有效的治療手段，中醫(yī)藥治療本病具有一定特色和優(yōu)勢(shì)[5]，可以明顯改善癥狀，提高生活質(zhì)量，但是關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。因此，本試驗(yàn)建立了慢性疲勞綜合征大鼠模型，運(yùn)用炙甘草湯進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)體質(zhì)量、曠場(chǎng)試驗(yàn)、力竭游泳試驗(yàn)和血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12水平的影響，以探討其防治慢性疲勞綜合征的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1動(dòng)物和飼料SD健康雄性大鼠45只，SPF級(jí)，10周齡，體重量200 g±10 g,基礎(chǔ)飼料,均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2013—0002。

1.1.2藥品炙甘草湯(炙甘草15 g，生姜10 g，桂枝10 g，人參6 g，生地黃15 g，阿膠6 g，麥冬10 g，麻仁10 g，大棗15 g)，由廣東康美藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)營(yíng)許可證號(hào)為粵AA2001217；將上述中藥飲片加8倍量的水浸泡30 min后，煎煮40 min取藥液過(guò)濾另存，再加6倍量的水煎煮40 min后取液過(guò)濾，將2次藥液混合，置于100℃環(huán)境濃縮至1 mL，相當(dāng)于原藥6 g，置于冰箱保存；生理鹽水，上海百特醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：10 mL/支，批號(hào)2017010。

1.1.3試劑和儀器大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12 ELLISA試劑盒，Intivrogen公司產(chǎn)品；上海恒平AE523C電子分析天平，購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TGL16D冷凍離心機(jī)，購(gòu)自湖南邁達(dá)儀器有限公司；日立熒光分光光度計(jì)F-2700，購(gòu)自廣州市儀德科學(xué)儀器有限公司；水合氯醛，揚(yáng)州市奧鑫助劑廠產(chǎn)品；902-ULTS超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1造模方法和分組所有大鼠在造模前置于室溫24℃±2℃和濕度50%±5%條件下給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后隨機(jī)分為空白對(duì)照組(15只)、模型組(15只)和炙甘草湯組(15只)，每5只分籠喂養(yǎng)。模型組和炙甘草湯組采取慢性束縛法加冷水游泳法，隔天交替進(jìn)行建立慢性疲勞綜合征模型。單日進(jìn)行慢性束縛法：自制束縛筒，大小以裝進(jìn)大鼠但是其頭部不能自由轉(zhuǎn)動(dòng)為宜，將大鼠頭向通風(fēng)口鉆進(jìn)束縛筒，調(diào)節(jié)其不強(qiáng)烈反抗，后架于木板上，每次束縛30 min，隔天進(jìn)行。雙日進(jìn)行冷水游泳法：制備大小190 cm×80 cm×80 cm的游泳池，設(shè)置水深50 cm，水溫10℃±1℃，每次將大鼠放入游泳8 min，隔天進(jìn)行。共造模4周。造模期間所有大鼠均自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料和蒸餾水。

1.2.2給藥方法參照人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表，炙甘草湯組給予12 g/kg炙甘草湯灌胃，日灌胃1次?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水灌胃，給藥周期為2周。

1.2.3試驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)采血前禁食不禁飲12 h， 100 g/L水合氯醛溶液(3 mL/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，經(jīng)頸總動(dòng)脈取血10 mL，3 000 r/min離心20 min后取血清，置-70℃保存。ELISA法測(cè)定血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12的水平。

1.2.4曠場(chǎng)試驗(yàn)將大鼠置于地面為25個(gè)等面積的方格和內(nèi)壁涂黑的箱子(80 cm×80 cm×80 cm)內(nèi)，測(cè)定6 min內(nèi)大鼠穿越方格的格數(shù)(以四爪均進(jìn)入同一方格為準(zhǔn))為水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)，以后肢垂直(前爪騰空或攀附箱壁)為直立次數(shù)。

1.2.5力竭游泳時(shí)間將大鼠置于水深50 cm，溫度25℃±1℃的泳池中進(jìn)行游泳，以大鼠入水至頭部10 s不能浮出水面為力竭游泳時(shí)間。

2　結(jié)果

2.1　各組大鼠體重檢測(cè)結(jié)果

造模4周后，模型組和炙甘草湯組大鼠的體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。藥物干預(yù)2周后，模型組體重顯著低于對(duì)照組，炙甘草湯組體重較模型組顯著升高(P<0.05)(表1)。

2.2　各組大鼠力竭游泳時(shí)間、穿格次數(shù)及直立次數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

造模4周后，模型組和炙甘草湯組大鼠的力竭游泳時(shí)間、穿格次數(shù)、直立次數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。藥物干預(yù)2周后，模型組力竭游泳時(shí)間、穿格次數(shù)、直立次數(shù)顯著低于對(duì)照組，炙甘草湯組力竭游泳時(shí)間、穿格次數(shù)、直立次數(shù)較模型組顯著升高(P<0.05)(表2)。

表1　各組大鼠體重檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

2.3　各組大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6及IL-12的檢測(cè)結(jié)果

藥物干預(yù)2周后，模型組血清IL-1β、IL-6顯著高于對(duì)照組，而血清IL-2、IL-12水平顯著降低，差異顯著(P<0.05)；與模型組比較，炙甘草湯組血清IL-1β、IL-6顯著降低，而血清IL-2、IL-12水平顯著升高(P<0.05)(表3)。

表2　各組大鼠力竭游泳時(shí)間、穿格次數(shù)及直立次數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

表3　各組大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6及IL-12的檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

3　討論

慢性疲勞綜合征主要為極度的體力疲勞和腦力疲勞，其特征為低熱、肌肉酸痛、疲倦乏力、免疫學(xué)異常等，是機(jī)體的一種亞健康狀態(tài)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療慢性疲勞綜合征主要以補(bǔ)充維生素和營(yíng)養(yǎng)為主，效果不佳，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確[6]。有研究顯示，免疫系統(tǒng)功能紊亂在慢性疲勞綜合征的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用，其中細(xì)胞因子與慢性疲勞綜合征息息相關(guān)，慢性免疫激活狀態(tài)導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放增多或減少，從而擾亂神經(jīng)遞質(zhì)的功能，導(dǎo)致CFS癥狀出現(xiàn)[7]。IL-1β是急性期免疫調(diào)節(jié)因子，其可以直接作用于垂體-腎上腺素軸，促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放增加，介導(dǎo)機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。有研究指出，大鼠運(yùn)動(dòng)應(yīng)激后血清IL-1β水平持續(xù)升高，提示免疫功能低下[8]。IL-6是疲勞誘導(dǎo)因子，有研究指出，疲勞患者其血清IL-6分泌增加，給予IL-6激活劑后可增加疲勞感，反之給予IL-6抑制劑可減輕疲勞感[9]。IL-6同樣可以促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放而介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)。IL-1β和IL-6不僅影響攝食、睡眠，還可以誘導(dǎo)疲勞、抑郁等不良精神癥狀，出現(xiàn)疲倦乏力、肌肉酸痛等疲勞綜合征[10-11]。IL-2是一種重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，由T細(xì)胞分泌產(chǎn)生，通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而促進(jìn)免疫應(yīng)答，其水平越高，提示免疫功能越好。IL-12是一種多功能免疫調(diào)節(jié)因子，不僅可以介導(dǎo)T輔助細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，而且在免疫過(guò)程具有重要的作用，其水平越高，提示免疫功能越正常。

關(guān)于慢性疲勞綜合征大鼠模型建立的方法主要有慢性束縛法、冷水游泳法、電刺激法、跑臺(tái)法、夾尾應(yīng)激法、免疫誘導(dǎo)法等。慢性疲勞綜合征是一個(gè)多因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果，一般有負(fù)面情緒、生活刺激、精神緊張、勞累等多因素的長(zhǎng)期影響，因此決定了CFS大鼠的造模方法是一個(gè)復(fù)合應(yīng)激法。冷水游泳法不僅可以誘導(dǎo)大鼠疲勞，而且可以誘導(dǎo)絕望情緒的產(chǎn)生。慢性束縛法可以誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)抑郁、焦慮、憤怒等不良情緒，產(chǎn)生心理應(yīng)激。本組試驗(yàn)采用慢性束縛法加冷水游泳法建立慢性疲勞綜合征大鼠模型，結(jié)果提示，造模4周后模型組大鼠體質(zhì)量、力竭游泳時(shí)間、穿格次數(shù)、直立次數(shù)顯著減少(P<0.05)，提示慢性疲勞綜合征大鼠模型復(fù)制成功。

慢性疲勞綜合征屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇[12]，其病機(jī)總屬于氣血陰陽(yáng)虧虛[13-14]。炙甘草湯出自《傷寒論》，為治療虛勞病之經(jīng)典名方。方中炙甘草、生地益氣養(yǎng)陰，人參大補(bǔ)元?dú)?，大棗、麥冬、阿膠、麻仁滋陰養(yǎng)血，生姜、桂枝溫陽(yáng)益氣，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)血、滋陰復(fù)脈之功效[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模成功后慢性疲勞綜合征大鼠給予藥物灌胃2周后，炙甘草組大鼠體質(zhì)量、力竭游泳時(shí)間、穿格次數(shù)、直立次數(shù)等顯著高于模型組，血清IL-1β、IL-6水平顯著降低，IL-2、IL-12水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明炙甘草湯可以降低代謝綜合征大鼠血清IL-1β、IL-6水平，提高IL-2、IL-12水平，改善疲勞癥狀，發(fā)揮治療慢性疲勞綜合征的作用。

綜上所述，炙甘草湯對(duì)治療慢性疲勞綜合征是有效的，可以改善疲勞癥狀，可能與其抑制血清IL-1β、IL-6的表達(dá)，促進(jìn)IL-2、IL-12的表達(dá)有關(guān)。