豬瘟病毒在豬體組織中的分布

張秋雨，李　鵬，陳　晴，任鵬舉，銀　梅*，王選年*

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心/生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450000)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)俗稱“爛腸瘟”,是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病,臨床上以高熱稽留、精神極度沉郁及黏膜廣泛性出血等為主要特征。CSF呈世界范圍分布,不同的國(guó)家其流行程度也有差異,其發(fā)病率和病死率很高,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病,并將該病列為國(guó)際重點(diǎn)檢疫對(duì)象[1]。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)CSF的診斷方法有傳統(tǒng)的病毒分離鑒定、免疫熒光試驗(yàn)、豬體回歸感染試驗(yàn)、血清學(xué)診斷及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等。這些方法都有各自的缺陷與不足,均不能滿足當(dāng)前疾病診斷的需求及對(duì)樣品中病毒含量進(jìn)行高靈敏度分析的要求[2-6]。而TaqMan qPCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種核酸擴(kuò)增技術(shù),增加一個(gè)特定的水解探針,具有特異性強(qiáng)、敏感性高和重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì),已經(jīng)被廣泛用于動(dòng)物檢疫和食品行業(yè)等病原體的檢測(cè),可以對(duì)樣品中的病毒載量實(shí)現(xiàn)真正的動(dòng)態(tài)定量[7]。CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員,具有囊膜,病毒粒子的基因組為單股正鏈的RNA,其大小為12.3 kb,包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF),兩端的非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)高度保守。E0蛋白是一種病毒吸附蛋白,是CSFV最重要的糖蛋白之一。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8],E0蛋白具有RNA酶的活性,在細(xì)胞中的表達(dá)、復(fù)制和調(diào)控機(jī)制等方面發(fā)揮重要作用。同時(shí),國(guó)際上常常把E0基因作為是否感染CSFV的檢測(cè)依據(jù)。E0蛋白在該病的防控和致病過(guò)程中發(fā)揮極其重要的關(guān)鍵作用[9]，它可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),以阻斷CSFV對(duì)機(jī)體的感染。當(dāng)豬感染CSFV后,其結(jié)構(gòu)糖蛋白E0可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,具有較強(qiáng)的免疫相關(guān)性,因而把E0基因的作為檢測(cè)的標(biāo)記物具有重要的意義[10]。

本研究是以規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)遇到的一例典型的CSF病例,剖檢后進(jìn)行病毒的分離鑒定。同時(shí),以CSFV相對(duì)保守的E0基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物和探針,建立一種特異、快速和準(zhǔn)確的CSFVTaqMan qPCR檢測(cè)方法,并檢測(cè)CSFV在豬體內(nèi)組織中的定量分布情況。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1病毒的基因組、質(zhì)粒及試劑CSFV標(biāo)準(zhǔn)株(cDNA)、豬細(xì)小病毒(cDNA)、豬圓環(huán)病毒(DNA)、豬流行性腹瀉病毒(cDNA)、pMD19-T-E0質(zhì)粒，均由河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；2×ESTaqMasterMix、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2病料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物河南新鄉(xiāng)輝縣某種豬場(chǎng)1頭疑似感染豬瘟病毒急性發(fā)病死亡的豬尸體；新西蘭兔(2 kg左右)，購(gòu)自華蘭生物疫苗有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2　方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成參考GenBank公布的CSFV E0基因(登錄號(hào)：KY816734.1)的相對(duì)保守核苷酸序列,根據(jù)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則,利用Preimer5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物和探針(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　RT-PCR及TaqMan qPCR引物和探針信息

1.2.2實(shí)驗(yàn)室診斷

1.2.2.1病豬剖檢 對(duì)病死豬尸體進(jìn)行剖檢，并無(wú)菌取出病豬的心臟、肝臟、淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、血液和腸道等組織器官送實(shí)驗(yàn)室待檢。

1.2.2.2RT-PCR按照Trizol kit試劑盒說(shuō)明書,從病變的組織樣品中提取RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為PCR的模板。PCR反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 8.2 μL,上、下游引物E0 F1、E0 R1各0.3 μL,模板1.5 μL,2×ESTaqMasterMix 10 μL; PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 40 s，58 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,循環(huán)35次;最后進(jìn)行72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,膠回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2.3免疫交互試驗(yàn)將豬尸體的淋巴結(jié)和脾臟充分剪碎研磨后，用無(wú)菌的生理鹽水按1∶5稀釋，5 000 r/min離心10 min后取上清,取2只健康且體重接近的家兔,按4 mL/只進(jìn)行肌肉注射,另外取2只家兔注射生理鹽水作為對(duì)照組。1周后對(duì)上述4只家兔耳緣靜脈注射1∶10的豬瘟兔化弱毒(0.5 mL/只),24 h后,每間隔6 h測(cè)定1次體溫,共測(cè)16次。在攻毒后,對(duì)照組2/3以上不出現(xiàn)定型熱或輕型熱，則表明免疫交互試驗(yàn)成立，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.2.3TaqMan熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將重組質(zhì)粒pMD19-T-E0，梯度稀釋為1010～103拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品(模板)，進(jìn)行TaqMan qPCR。通過(guò)前期的預(yù)試驗(yàn)對(duì)TaqMan熒光定量PCR的反應(yīng)條件和參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,確定其最優(yōu)的反應(yīng)體系為10 μL：2×PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物E0 F2和E0 R2各0.2 μL,探針0.2 μL,模板1 μL,ddH2O 3.4 μL;最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；94℃ 15 s,58℃ 30 s,72℃ 10 s,同時(shí)捕捉FAM信號(hào),進(jìn)行40個(gè)循環(huán),軟件自動(dòng)生成動(dòng)力學(xué)曲線和熔解曲線,并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2　診斷CSF的兔體交互試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

注：+：有發(fā)熱；-：無(wú)發(fā)熱。

Note：+：Fever；-：No fever.

1.2.4TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性和重復(fù)性分析以CSFV石門株、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等病毒的DNA或cDNA為模板,同時(shí)用水作為空白對(duì)照,進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),并根據(jù)熒光信號(hào)的變化判斷其特異性。按照上述建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件和體系,以107拷貝/μL～105拷貝/μL重組質(zhì)粒為模板,分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn),對(duì)稀釋的每一個(gè)拷貝數(shù)進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)試驗(yàn),驗(yàn)證其穩(wěn)定性。并根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)“S”形曲線而變化的熒光信號(hào)強(qiáng)度,求出Ct值,然后把Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該樣品檢測(cè)的起始濃度。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算其變異系數(shù)(CV)。

1.2.5TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CSFV在組織中的分布病死豬剖檢后,采集各部位的病料,包括心臟、肝臟、淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、血液及腸道等器官和組織。按照RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取各樣品的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各樣品中病毒含量的分布。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn),同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2　結(jié)果

2.1　病理變化

剖檢的主要病理變化為眼結(jié)膜潮紅,腹部、臀部、耳部、頸部和四肢內(nèi)側(cè)等皮膚出現(xiàn)暗紫色斑且全身彌漫性出血和壞死(圖1A)；皮下組織有彌漫性出血點(diǎn),血液凝固不良(圖1B)；脾臟邊緣有多個(gè)較硬的出血梗死,呈黑色,大小不一；心肌外膜出血；肺臟有散在的出血病變和輕微的梗死(圖1C)；可見(jiàn)腎臟表面蒼白有針尖狀的出血點(diǎn)或大的出血斑(圖1D)，出血部位以皮質(zhì)表面多見(jiàn),呈現(xiàn)典型的“雀斑腎”外觀,其皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域有嚴(yán)重的多量點(diǎn)狀出血,水腫,呈紅黃色,腎盂黏膜有嚴(yán)重的彌漫性出血(圖1E,圖1F)；腸道漿膜和回盲口處有小的點(diǎn)狀出血斑,大腸黏膜上形成近似圓形的紐扣狀潰瘍?cè)?圖1G)；胃黏膜有出血(圖1H)；肋骨和肋骨膜有嚴(yán)重的出血斑點(diǎn)病變，肋骨近端到肋軟骨交界部位有明顯的骨化線(圖1I)。

2.2　RT-PCR擴(kuò)增

以CSFV的cDNA為模板對(duì)E0基因進(jìn)行擴(kuò)增,其產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳顯示其條帶大小為626 bp(圖2),陰性對(duì)照擴(kuò)增后無(wú)條帶。測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的E0基因的標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank登錄號(hào)：KY816734.1)經(jīng)BLAST比對(duì),核苷酸序列的同源性為100%。

圖1　疑似CSF病豬剖檢后的大體病變

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.陰性對(duì)照；2～8.檢測(cè)樣品分別為心臟、肝臟、血液、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)和腸道組織

M.DNA Marker DL 1 000；1.Negative control；2-8.Samples form heart,liver,blood,kidney,spleen,lymph nodes and intestinal tissues

圖2CSFV的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.2RT-PCR detection results of CSFV

2.3　兔體交互試驗(yàn)

注射疫苗和病料后每隔6 h測(cè)量體溫1次,連續(xù)測(cè)96 h(表3)。試驗(yàn)組的A號(hào)、B號(hào)家兔體溫變化范圍分別為39.5℃～41.9℃、39.6℃～41.3℃,溫差1.7℃～2.4℃,說(shuō)明試驗(yàn)組注射病料和免疫豬瘟兔化弱毒疫苗后均出現(xiàn)明顯熱型反應(yīng),則表明被檢病料中含有CSFV強(qiáng)毒。而對(duì)照組的C號(hào)、D號(hào)家兔注射生理鹽水后沒(méi)有出現(xiàn)熱型反應(yīng),表明整個(gè)試驗(yàn)成立。

表3　各組試驗(yàn)兔體溫變化情況

2.4　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以1010拷貝/μL～103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為TaqMan qPCR的模板,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,其擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3A,得到的熔解曲線較好,只出現(xiàn)整齊單一的特異性峰,沒(méi)有引物二聚體現(xiàn)象(圖3B),軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3C,其擴(kuò)增效率為99.76%,標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)值為0.998 9,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.295x+8.96。

2.5　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性

以CSFV標(biāo)準(zhǔn)株(cDNA)、豬細(xì)小病毒(cDNA)、豬圓環(huán)病毒(DNA)和豬流行性腹瀉病毒(cDNA)等樣品作為模板,采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的CSFV E0基因的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，只有CSFV標(biāo)準(zhǔn)株出現(xiàn)單一、特異性的“S”形曲線(圖4),而其他陰性對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)出陽(yáng)性峰值信號(hào)。

2.6　TaqMan熒光定量PCR方法的重復(fù)性

以3個(gè)不同的濃度梯度的重組質(zhì)粒作為模板，用TaqMan qPCR進(jìn)行檢測(cè)，其組間和組內(nèi)的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的Ct值和變異系數(shù)見(jiàn)表4,該方法的批內(nèi)變異系數(shù)為0.14%～1.62%,批間變異系數(shù)為0.64%～1.52%,其變異系數(shù)均小于2%，表明該方法不但具有良好的重現(xiàn)性,而且穩(wěn)定性也比較好,其中陰性對(duì)照(N)沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，無(wú)擴(kuò)增曲線產(chǎn)生。

2.7　檢測(cè)臨床樣品中CSFV在組織中的分布情況

以本實(shí)驗(yàn)室診斷由于急性感染CSFV死亡的豬,剖檢后取體內(nèi)各組織臟器,并分別提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板,進(jìn)行TaqMan qPCR檢測(cè),從圖5中可知E0基因的的擴(kuò)增曲線良好,熔解曲線整齊單一，且沒(méi)有其他雜峰出現(xiàn)。淋巴結(jié)中CSFV含量最高,其次為脾臟、腎臟、腸道組織、血液和心臟,肝臟中CSFV含量最低,對(duì)照組未檢測(cè)出病毒RNA。

3　討論

豬瘟是一種具有高度傳染性的疾病,其傳播快、流行廣,多為混合感染,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于豬瘟的診斷方法有病毒分離鑒定、原位雜交、免疫組化、RT-PCR和RT-nPCR[7,11]等。但傳統(tǒng)的檢測(cè)方法十分繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高,不適合大樣本量的檢測(cè)。而分子生物學(xué)方法中的RT-PCR容易引起交叉污染,且不能準(zhǔn)確定量，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好，可以對(duì)組織中的病毒進(jìn)行定量分析等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用,但對(duì)于CSFV的早期感染的鑒別診斷還存在著許多缺陷。而TaqMan qPCR是在RT-PCR的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)TaqMan探針,該方法具有很高的特異性、敏感性和重復(fù)性，尤其是對(duì)于CSFV的早期臨床診斷提供了一個(gè)較為可靠的工具。

A.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；B.熔解曲線；1～8.質(zhì)粒濃度分別為1010拷貝/μL～103拷貝/μL；C.標(biāo)準(zhǔn)曲線

A.Standard plasmid；B.Dissolution curve;1-8.Plasmid concentrations were 1010-103copies/μL;C.Standard curve

圖3以質(zhì)粒為模板的TaqMan熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.3Standard curves ofTaqMan fluorescent quantitative PCR with plasmid as template

1.CSFV cDNA;2.豬細(xì)小病毒cDNA;3、4.分別為豬圓環(huán)病毒DNA和豬流行性腹瀉病毒cDNA；5.陰性對(duì)照

1.CSFVcDNA;2.Porcine parvovirus cDNA;3，4.Porcine circovirus cDNA and porcine epidemic diarrhea virus cDNA,respectively；5.Negative control

圖4　TaqMan熒光定量PCR特異性檢驗(yàn)動(dòng)力學(xué)曲線

圖5　TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)CSFV在組織中的分布

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)臨床遇到的一例典型疑似豬瘟病死豬,通過(guò)大體病變、RT-PCR及兔體交互試驗(yàn)進(jìn)行診斷,確定該病死豬由于感染CSFV而引起的急性死亡。但目前還沒(méi)有完全了解CSFV感染機(jī)體后的病毒復(fù)制、增殖、分布、組織嗜性和傳播特性等一系列問(wèn)題。因此,為了更進(jìn)一步了解CSFV侵入機(jī)體后在組織中分布和病豬死亡的相關(guān)性，本試驗(yàn)根據(jù)CSFV E0基因的相對(duì)保守核苷酸序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和探針,建立了檢測(cè)CSFV 的TaqMan qPCR方法,該方法只對(duì)CSFV cDNA有陽(yáng)性擴(kuò)增曲線,且重復(fù)性較好。而對(duì)豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)均沒(méi)有陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，表明該方法的特異性強(qiáng)。本試驗(yàn)對(duì)遇到的典型臨床死亡的豬瘟病例進(jìn)行剖檢后,對(duì)體內(nèi)各組織器官中的病毒含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示，CSFV感染豬后其主要侵襲部位為淋巴結(jié)、心臟、血液、脾臟、腎臟和腸道等組織。在本次研究中也發(fā)現(xiàn)，血清中病毒含量也相對(duì)比較高,這可能是當(dāng)豬感染CSFV急性死亡后,通過(guò)糞便和尿液向外界排毒,從而引起病毒可以通過(guò)全身傳播進(jìn)而對(duì)外界環(huán)境造成污染和傳播疫病[12]。同時(shí),這些檢測(cè)結(jié)果也提示,CSFV存在于該死亡豬的全身各個(gè)組織器官及血液當(dāng)中,可能是造成豬急性死亡的主要原因。

CSFV在淋巴組織和血液中的病毒載量幾乎是最高的,同時(shí),心臟、十二指腸、腦、胃和骨骼肌的病毒含量相對(duì)較低。一般認(rèn)為,當(dāng)豬感染CSFV后扁桃體是病毒載量最豐富的組織,而這次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只有中等的病毒含量,這可能與動(dòng)物的年齡、病毒毒力和劑量以及動(dòng)物分娩前后等因素有關(guān)[13-15]。這與DiasN L等[16]應(yīng)用TaqMan熒光定量PCR對(duì)145份病料的檢測(cè)結(jié)果差別較大,這可能與病毒的地區(qū)性毒株有一定的關(guān)系。Woniakowski G等[17]用SYBR Green熒光定量PCR分析了CSFV感染豬后其血液和組織樣品中的病毒含量；朱長(zhǎng)康[18]通過(guò)人工感染CSFV,用病理組織學(xué)方法,檢測(cè)各個(gè)臟器中CSFV載量，從而進(jìn)一步研究CSFV在體內(nèi)臟器的的動(dòng)態(tài)分布、臨床癥狀和組織嗜性的相關(guān)性。本試驗(yàn)的樣品來(lái)自臨床上由于感染豬瘟病毒后急性死亡的典型病豬作為研究對(duì)象,并利用建立的TaqMan qPCR檢測(cè)了急性死亡病例中CSFV在不同器官和血液中的分布情況,為進(jìn)一步開(kāi)展CSFV的定量檢測(cè)、綜合防控和感染機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。