實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠脾和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CD4+ T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化

羅　會(huì)，郭晴晴，呂愛(ài)平，何小鵑*，馬超英

(1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610031；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700；3.香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，香港 999077)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一類(lèi)發(fā)生在人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的自身免疫引起的神經(jīng)退行性疾病[1]。目前MS仍無(wú)有效的治愈方法，只能利用藥物減緩其進(jìn)展，控制病癥[2]。MS的發(fā)病機(jī)制尚未明確，近年來(lái)大多數(shù)的研究?jī)A向于認(rèn)為MS是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。當(dāng)抗原遞呈細(xì)胞在病毒感染或其他刺激因子的作用下活化的同時(shí)，共刺激分子與T細(xì)胞結(jié)合提供共刺激信號(hào)，特異性激活針對(duì)髓鞘抗原的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，后者增殖并分化穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入CNS與自身抗原結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)，破壞血腦屏障，從而使大量免疫細(xì)胞進(jìn)入CNS，并分泌多種淋巴因子破壞神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而導(dǎo)致以髓鞘脫失和軸索變性為特征的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[3-4]。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型(experimentally allergic encephalomyelitis，EAE))是人類(lèi)模擬MS的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在臨床表征和病理特征上與MS相似[5]。對(duì)MS和EAE動(dòng)物模型發(fā)病機(jī)理的研究，均證明CD4+T細(xì)胞是對(duì)自身抗原免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，在整個(gè)EAE的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮重要作用，也在多個(gè)部位，包括外周脾和CNS病灶部位都發(fā)揮致病效應(yīng)[6]。因此，研究不同時(shí)期不同部位EAE模型的CD4+T細(xì)胞的特征，可以更清晰地了解CD4+T細(xì)胞在EAE疾病進(jìn)程中的變化規(guī)律，有利于對(duì)EAE的疾病進(jìn)展有更清晰的認(rèn)識(shí)。

因此，本研究采用C57BL/6小鼠建立單向進(jìn)展型EAE模型，通過(guò)檢測(cè)外周脾和CNS在疾病不同時(shí)期CD4+T細(xì)胞，來(lái)研究不同部位的CD4+T細(xì)胞在疾病發(fā)展過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠共25只，10周齡～12周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016—0011，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2016—0021。所有動(dòng)物試驗(yàn)前先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，維持晝夜交替12 h光照，自由飲水及進(jìn)食，分籠(每籠5只)進(jìn)行飼養(yǎng)。試驗(yàn)遵守中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院相關(guān)規(guī)則制度，符合動(dòng)物倫理道德規(guī)范。

1.1.2試劑髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55:H-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH)，HPLC純度98.79%，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；完全弗氏佐劑(complete Freund adjuvant,CFA：含熱滅活結(jié)核分支桿菌H37Ra5 mg/mL)，美國(guó)Chondrex公司產(chǎn)品；百日咳毒素(pertussis toxin,PTX))，美國(guó)List Biological Laboratories公司產(chǎn)品；流式CD3和CD4抗體， BD公司產(chǎn)品；免疫組化CD4抗體，美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；免疫組化二抗(SignalStain○RBoost IHC Detection Reagent,HRP,Rabbit)、DAB顯色試劑盒(SignalStain○RDAB Substrate Kit)，美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1動(dòng)物分組及EAE造模雌性C57BL/6小鼠按體重隨機(jī)分為空白組、模型1、模型2、模型3和模型4組，共5組，每組5只。MOG35-55多肽用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分溶解并稀釋后與CFA等體積混合，在冰浴中用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿制得油包水狀的抗原乳化物。Day 0于模型組小鼠上腹部分兩點(diǎn)皮下注射含200 μg MOG35-55多肽的抗原乳劑共200 μL，并于Day 0、Day 2分別給予每只小鼠腹腔注射200 ng PTX，誘導(dǎo)單向進(jìn)展型EAE模型[7]。

空白組于Day 0取材，模型1組于Day 17取材，模型2組于Day 25取材，模型3組于Day 40取材，模型4組于Day 52取材。

1.2.2檢測(cè)

1.2.2.1動(dòng)物一般情況觀(guān)察從Day 0開(kāi)始，每天對(duì)小鼠狀態(tài)進(jìn)行觀(guān)察，對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考5分評(píng)分法，雙盲法進(jìn)行如下評(píng)分：1分：尾部張力降低；2分：中度后肢或前肢無(wú)力；3分：重度后肢或前肢無(wú)力；4分：四肢完全癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。中間情況以±0.5分計(jì)，小鼠神經(jīng)功能評(píng)分≥1分，即為發(fā)病[8]。

1.2.2.2脾單個(gè)核細(xì)胞分離處死小鼠，取脾，于細(xì)胞篩中研磨，細(xì)胞勻漿用細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，得到脾勻漿。脾勻漿于4℃、1 500 r/min離心5 min，收集脾細(xì)胞沉淀。加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫反應(yīng)5 min，加入2 mL培養(yǎng)基終止裂解。離心去上清，PBS清洗，得到脾單個(gè)核細(xì)胞[9]。

1.2.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)將脾單個(gè)核細(xì)胞按照每管1×106細(xì)胞/管分裝于流式管中，用200 μL PBS進(jìn)行混懸，常溫避光條件下添加CD3和CD4抗體染色20 min。流式管加入2 mL PBS，混勻后300 r/min離心5 min，倒棄上清，剩余50 μL～100 μL液體，加入100 μL PBS 重懸后，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2.4腦和脊髓固定及切片小鼠用5 mg/mL戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉，剪開(kāi)胸部，將灌注針由左心室穿入主動(dòng)脈，剪開(kāi)左心耳，依次注入9 g/L生理鹽水、40 g/L多聚甲醛灌注固定。然后完整取出全腦和脊髓，分別切取大腦視交叉層面2 mm左右的腦組織、腦干、頸髓、胸髓及腰髓固定于100 mL/L中性福爾馬林48 h。固定的標(biāo)本以0.01 mol/L pH 7.4的PBS沖洗，在梯度乙醇溶液(700、800、950、950、1 000、1 000 mL/L)中脫水，二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋制備成蠟塊。組織切片機(jī)取5 μm厚度連續(xù)切片，每間隔20 μm取1張，60℃烤干切片備用。

1.2.2.5免疫組化石蠟切片脫蠟至水，置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)在微波爐內(nèi)微波輻射10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，之后取出自然冷卻，蒸餾水洗3次，每次5 min。滴加30 mL/L H2O2室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加30 mg/mL BSA封閉30 min，去除封閉液，滴加稀釋1 000倍的CD4抗體，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色5 min，脫水，封片。免疫組化切片按照同一采集參數(shù)拍攝，每張切片隨機(jī)采集圖像10張，采用IPP(Image Pro Plus)圖像分析軟件進(jìn)行免疫組化定量分析，選擇陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值(integrated optical density,IOD)作為免疫組化結(jié)果半定量分析的指標(biāo)。

2　結(jié)果

2.1　小鼠的病情變化

小鼠從Day 14開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病率為100%，EAE小鼠發(fā)病表現(xiàn)為活動(dòng)少，進(jìn)食少，精神頹靡。隨后幾天逐漸出現(xiàn)尾部松弛無(wú)力，步態(tài)蹣跚，雙后肢依次呈現(xiàn)麻痹狀態(tài)，行動(dòng)困難的臨床癥狀，臨床評(píng)分隨著時(shí)間延長(zhǎng)加重，到達(dá)高峰期后癥狀稍微緩解，之后則基本保持在3分不變。發(fā)病過(guò)程如圖1所示。

2.2　脾CD4+ T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化

流式細(xì)胞儀檢測(cè)S1、S2、S3、S4這4個(gè)時(shí)期EAE小鼠的脾中CD4+T細(xì)胞比例，與空白組相比發(fā)病后CD4+T細(xì)胞比例顯著增加，并出現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，CD4+T細(xì)胞比例在S2期達(dá)到最大值，隨后降低(圖2)。

S1.發(fā)病初期；S2.發(fā)病高峰期；S3.平臺(tái)初期；S4.平臺(tái)后期

S1.Onset period;S2.Peak period;S3.Early platform period;S4.Late platform period

圖1EAE小鼠發(fā)病評(píng)分

Fig.1Clinical score of EAE mice

S1.發(fā)病初期；S2.發(fā)病高峰期；S3.平臺(tái)初期；S4.平臺(tái)后期

S1.Onset period;S2.Peak period;S3.Early platform period;S4.Late platform period

圖2不同時(shí)間點(diǎn)脾中CD4+T細(xì)胞流式結(jié)果

Fig.2The percentage of CD4+T cells in spleen detected by flow cytometry at different periods

2.3　中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同時(shí)期不同部位CD4+ T細(xì)胞的免疫組化結(jié)果

免疫組化檢測(cè)S1、S2、S3、S4這4個(gè)不同時(shí)期，EAE小鼠大腦、腦干、頸髓、胸髓、腰髓的CD4+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，結(jié)果如圖3所示。相較于正常組小鼠，EAE小鼠的大腦、腦干和各段脊髓在各個(gè)時(shí)期中均出現(xiàn)較為明顯的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)，其中脊髓的浸潤(rùn)情況最明顯，其次是大腦，再次腦干。在EAE的發(fā)展過(guò)程中，各個(gè)部位的CD4+T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。不同的是，大腦、腦干、胸髓和腰髓在S2期達(dá)到最大值，而頸髓在S3期達(dá)到最大值。

3　討論

MS及其動(dòng)物模型EAE是一類(lèi)主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，CD4+T細(xì)胞在EAE的發(fā)病中起到關(guān)鍵的作用[19]。對(duì)MS和EAE動(dòng)物模型發(fā)病機(jī)理的研究，均證明CD4+T細(xì)胞是對(duì)自身抗原免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞[11]。而當(dāng)激活的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞進(jìn)入CNS后，增殖分化，并分泌多種炎癥因子，對(duì)CNS起到破壞作用[12]。因此，CD4+T細(xì)胞在整個(gè)EAE的發(fā)生和發(fā)展中都發(fā)揮重要作用，也在多個(gè)部位，包括外周脾和CNS病灶部位都發(fā)揮致病效應(yīng)[13]。為了對(duì)EAE的發(fā)病過(guò)程以及CD4+T細(xì)胞在疾病發(fā)展過(guò)程中的作用有更加清楚地認(rèn)識(shí)，了解在外周和CNS的CD4+T細(xì)胞隨疾病進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化是十分必要的。

S1.發(fā)病初期；S2.發(fā)病高峰期；S3.平臺(tái)初期；S4.平臺(tái)后期

S1.Onset period;S2.Peak period;S3.Early platform period;S4.Late platform period

圖3不同時(shí)期CNS不同部位CD4+T細(xì)胞免疫組化結(jié)果(200×)

Fig.3Immunohistochemistry result of CD4+T cells infiltration in different parts of CNS at different periods(200×)

本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于空白組小鼠，EAE小鼠的脾和CNS中的CD4+T細(xì)胞均顯著增加，這與之前的研究是一致的，再次證明CD4+T細(xì)胞在EAE疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。另外，脾和CNS的CD4+T細(xì)胞隨疾病進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化一致，基本于發(fā)病初期上升，發(fā)病高峰期出現(xiàn)峰值，平臺(tái)初期下降，該結(jié)果提示CD4+T細(xì)胞可能在發(fā)病初期和發(fā)病高峰期發(fā)揮較重要的致病效應(yīng)。在平臺(tái)期，CD4+T細(xì)胞反而有所下降，考慮原因可能是機(jī)體對(duì)炎性改變的自我反應(yīng)所致[14]。由于CNS中的CD4+T細(xì)胞是由外周進(jìn)入的，脾和CNS的CD4+T細(xì)胞隨疾病進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化一致，可以推測(cè)EAE小鼠CNS的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)是受外周的CD4+T細(xì)胞數(shù)量變化的影響的，故可以通過(guò)干預(yù)外周CD4+T細(xì)胞的數(shù)量來(lái)降低CNS的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)。

在EAE模型中，大腦、腦干和脊髓中均為炎癥部位[15]，研究CNS不同部位CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況，可以增加對(duì)EAE病理特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為進(jìn)行EAE的CD4+T細(xì)胞相關(guān)研究的CNS取材部位提供參考。故選擇大腦、腦干、頸髓、胸髓和腰髓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EAE小鼠CNS的不同部位中，以脊髓浸潤(rùn)最為明顯。在EAE不同時(shí)期中，以發(fā)病初期、高峰期和平臺(tái)初期的浸潤(rùn)較明顯。本研究結(jié)果提示，選取C57BL/6小鼠建立單向進(jìn)展型EAE模型進(jìn)行有關(guān)CD4+T細(xì)胞的研究時(shí)，取材時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。對(duì)于CNS進(jìn)行CD4+T細(xì)胞的研究盡量選取脊髓，特別是腰髓段，若需要EAE小鼠發(fā)病較長(zhǎng)時(shí)間后研究，盡量選擇頸髓段。