SIRT1激動(dòng)劑對(duì)大鼠急性心肌梗死后心臟功能、心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

孫彬，曹清濤，劉金偉，李雅妮

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院,山東濰坊262500；2濰坊市人民醫(yī)院)

急性心肌梗死(AMI)已成為我國(guó)居民首位死因[1]，藥物、介入、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等治療技術(shù)不斷進(jìn)展，在挽救患者生命及降低病死率方面發(fā)揮重要作用[2]。但是，缺血再灌注損傷及心室重構(gòu)的存在，嚴(yán)重影響了療效及預(yù)后[3]。研究[4]表明，繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)生及進(jìn)展的重要病理機(jī)制。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)作為輔酶Ⅰ依賴(lài)性的去乙?；?，在能量平衡、DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖、分化及凋亡、炎癥等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。有研究[6]指出，SIRT1可減輕肝移植術(shù)后缺血再灌注肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷；亦有研究[7]指出，耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過(guò)激活SIRT1信號(hào)通路而保護(hù)大鼠心肌。2017年9～12月，我們觀察了SIRT1激動(dòng)劑SRT1720對(duì)AMI大鼠心臟功能及心肌細(xì)胞凋亡的影響，以及可能的機(jī)制，以期為該病臨床診療提供新的線索。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑、設(shè)備40只健康雄性SD大鼠購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK(魯)20130009)]，8周齡，體質(zhì)量250～280 g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。SRT1720購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，二甲基亞砜(DMSO)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HE染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，Masson染色試劑購(gòu)自北京華越洋生物科技公司，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑總廠試劑三廠；兔抗大鼠SIRT1多克隆抗體、乙酰賴(lài)氨酸單克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗大鼠叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FoxO1)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自上海滬峰化工有限公司；超聲顯像儀購(gòu)自荷蘭PHILIPS公司，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與AMI模型建立采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、溶媒組和激動(dòng)劑組，每組10只。后三組按照曹旭丹等[8]的方法結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，以心臟局部缺血、發(fā)紺且心電圖ST段抬高為構(gòu)建AMI模型成功。假手術(shù)組僅充分暴露心臟，將縫合絲線穿過(guò)而不結(jié)扎。激動(dòng)劑組、溶媒組分別腹腔注射SIRT1激動(dòng)劑SRT1720 20 mg/(kg·d)及等量的DMSO，假手術(shù)組、模型組均腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組死亡1只，補(bǔ)充后保持樣本量不變；其余各組均無(wú)死亡。

1.2.2大鼠心臟功能檢查各組于末次給藥后次日，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠；用超聲顯像儀行超聲心動(dòng)圖檢查，分別檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(FS)。各指標(biāo)均檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.3大鼠梗死組織形態(tài)學(xué)檢查于心臟功能檢查后，處死各組大鼠；留取梗死區(qū)心肌組織，用4%甲醛固定。切片，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，厚度約4 μm；按照HE染色試劑盒說(shuō)明完成操作，觀察大鼠梗死區(qū)組織形態(tài)；利用Masson染色試劑染色后觀察梗死區(qū)纖維化情況，纖維化組織被染成藍(lán)色。

1.2.4大鼠梗死組織中細(xì)胞凋亡情況觀察取梗死區(qū)心肌組織，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，厚度約0.4 μm。按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色，DAB顯色，高倍鏡下觀察。以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒狀物為陽(yáng)性，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1、Bax和Bcl-2蛋白檢測(cè)取梗死區(qū)心肌組織，研磨勻漿后，加入細(xì)胞裂解液；用總蛋白提取試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行提取，采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。取50 μg總蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉120 min。加入一抗兔抗大鼠SIRT1多克隆抗體、兔抗大鼠FoxO1單克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體和兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體(稀釋比例分別為1∶ 500、1∶ 1 200、1∶ 800和1∶ 1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育，TBST沖洗3次；加入二抗，室溫孵育60 min，TBST沖洗3次；加入化學(xué)發(fā)光液避光反應(yīng)15 min，顯影，拍照。用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參獲得SIRT1、FoxO1、Bax和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6大鼠梗死組織中FoxO1乙?；綑z測(cè)參照1.2.5的方法提取總蛋白，并測(cè)定總蛋白濃度。按照每1 mg總蛋白加入3 μg的乙酰賴(lài)氨酸單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜孵育。按照1.2.5的方法分別檢測(cè)FoxO1和酰賴(lài)氨酸表達(dá)水平，以FoxO1與酰賴(lài)氨酸電泳灰度值比值反映FoxO1乙?；?。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠心臟功能比較見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠心臟功能比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與溶媒組比較，cP<0.05。

2.2各組大鼠梗死組織形態(tài)學(xué)變化Masson和HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組和溶媒組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量變性壞死，胞核固縮，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間膠原纖維顯著增加；與模型組和溶媒組比較，激動(dòng)劑組大鼠心肌細(xì)胞變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞間膠原纖維減少。

2.3各組大鼠梗死區(qū)組織中細(xì)胞凋亡情況假手術(shù)組、模型組、溶媒組和激動(dòng)劑組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為9.53%±1.17%、42.38%±3.44%、39.93%±2.75%、21.26%±3.01%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=328.700，P=0.000)；兩兩比較，模型組、溶媒組>激動(dòng)劑組>假手術(shù)組(P均<0.05)；模型組、溶媒組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)無(wú)差異(P=0.053)。

2.4各組大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)和FoxO1乙?；奖容^見(jiàn)表2。

3　討論

AMI是臨床常見(jiàn)危重癥，近年來(lái)發(fā)病率不斷升高且呈年輕化趨勢(shì)[9]，給患者生命健康及家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重影響。研究[10]表明，心肌細(xì)胞凋亡和膠原纖維增生是導(dǎo)致心肌梗死后心力衰竭甚至死亡的主要病理過(guò)程。目前，現(xiàn)有的治療手段(藥物或介入治療)雖在一定程度上可改善患者預(yù)后，但并不能促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，甚至可能會(huì)加速心肌細(xì)胞凋亡及心室重構(gòu)[11]。因此，如何有效阻止心肌細(xì)胞凋亡對(duì)改善AMI患者預(yù)后具有重要意義。

表2　各組大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)和FoxO1乙?；奖容^

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與溶媒組比較，cP<0.05。

SIRT1作為一種去乙?；?，可通過(guò)調(diào)控組蛋白/非組蛋白去乙?；诩?xì)胞凋亡、線粒體功能、能量代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。有研究[13]指出，激活SIRT1信號(hào)通路可減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。亦有研究[14]指出，SIRT1參與了糖尿病心肌損傷過(guò)程。SRT1720是新近研制的一種SIRT1激動(dòng)劑，可特異性提高SIRT1蛋白表達(dá)及活性[15]。本研究利用腹腔注射SRT1720的方法對(duì)AMI大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)激動(dòng)劑組大鼠梗死組織中SIRT1蛋白表達(dá)升高，提示SRT1720可促進(jìn)大鼠梗死區(qū)組織中SIRT1蛋白表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，相比于假手術(shù)組，模型組和溶媒組大鼠LVEDD和LVESD均升高，LVEF和FS均降低；大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量變性壞死，胞核固縮，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間膠原纖維顯著增加；TUNEL法檢測(cè)結(jié)果亦顯示，M組和V組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高。這說(shuō)明AMI大鼠心功能降低，出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡及間質(zhì)纖維化。然而，激動(dòng)劑組大鼠心臟功能、心肌細(xì)胞凋亡及纖維化程度、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均較模型組和溶媒組改善或減少。這說(shuō)明激活SIRT1可有效改善心肌梗死大鼠心臟功能，減輕心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化。

自噬是正常生理情況下細(xì)胞代謝及自我更新過(guò)程，但在氧化應(yīng)激、炎癥等某些病理?xiàng)l件下可由于自噬過(guò)度激活而加速細(xì)胞凋亡，F(xiàn)oxO是調(diào)控自噬的關(guān)鍵性因子[16]。有研究[17]指出，SIRT1可通過(guò)調(diào)控FoxO乙?；蕉诩?xì)胞增殖、凋亡、代謝中發(fā)揮重要作用。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，而B(niǎo)ax則是促凋亡基因，二者在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，與模型組和溶媒組比較，激動(dòng)劑組大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而B(niǎo)ax蛋白相對(duì)表達(dá)量和FoxO1乙?；骄档汀＿@說(shuō)明SRT1720激活SIRT1蛋白表達(dá)可能通過(guò)抑制FoxO1乙?；剑龠M(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SIRT1激動(dòng)劑可改善AMI大鼠心臟功能，減少心肌細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與促進(jìn)SIRT1表達(dá)及活性，下調(diào)FoxO1乙?；接嘘P(guān)。