Cu²⁺單獨(dú)污染對(duì)藜麥種子萌發(fā)及部分生理指標(biāo)的影響

郝曉華 任美艷

摘 要：采用光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)及紫外可見(jiàn)分光光度法，研究了不同濃度（50～200μmol·L-1）Cu2+單獨(dú)污染對(duì)藜麥幼苗體內(nèi)可溶性蛋白的含量、SOD酶及過(guò)氧化氫酶的活性及其他生理特征的影響。結(jié)果表明，不同濃度的Cu2+對(duì)藜麥的可溶性蛋白含量、丙二醛含量以及葉片的相對(duì)電導(dǎo)率伴隨著Cu2+濃度的增加而增加；SOD酶及過(guò)氧化氫酶活性在隨著Cu2+濃度的增加而增加。在含有200μmol/lCu2+的環(huán)境下藜麥可以生存，但藜麥體內(nèi)的保護(hù)系統(tǒng)受到一定程度的破壞，然而在低濃度時(shí)，Cu2+對(duì)藜麥的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：Cu2+；藜麥；可溶性蛋白；SOD酶

中圖分類號(hào) S519 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）11-0016-05

Abstract：This article using the light incubator to cultivate and atomic absorption spectrophotometry， different concentrations of copper ion was studied after pollution quinoa seedlings in soluble protein content，superoxide dismutase（SOD） and catalase activity and other physical characteristics. The results show that： different concentrations of copper ion of quinoa soluble protein content， malondialdehyde content and relative electrical conductivity increased with the increasing of the concentration of cupric ions. Superoxide dismutase and catalase activity also increased with the increasing of concentration of Cu2+. So quinoa under the environment of containing the highest concentration of copper ion can survive， but protection system in the body of the quinoa by a certain degree is damaged， but in low concentration， the growth of quinoa has a certain role in promoting.

Key word：Copper ion；Chenopodium quinoa willd；Soluble protein；Superoxide dismutase（SOD）

藜麥（Chenopodium quinoa willd）為雙子葉植物綱石竹目藜科藜屬植物[1]，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等特性。原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是印加土著居民的主要傳統(tǒng)食物，至今已有5000～7000多年的種植歷史。由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，食用價(jià)值高，且植株在自然肥力低的情況下仍能生長(zhǎng)良好，被譽(yù)為未來(lái)最具潛力的農(nóng)作物之一[2]。植株呈掃帚狀，根系屬淺根系，序狀花序，主梢和側(cè)枝都結(jié)籽，自花授粉。

近年來(lái)，伴隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，環(huán)境也遭到了很大程度的破壞，如重金屬的污染使很多植物難以生存，或產(chǎn)量下降。Cu2+是一種重要的重金屬污染物，其在環(huán)境中易積累、難降解[1-2]，過(guò)量的銅可使作物細(xì)胞膜及多種細(xì)胞器的膜系統(tǒng)受損，使K+等從細(xì)胞中滲出，抑制多種酶的活性，從而造成毒害效應(yīng)[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)主要研究了不同濃度的重金屬Cu2+單一污染在藜麥幼苗體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶的活性以及可溶性蛋白和丙二醛含量的變化，為了解銅離子對(duì)藜麥的毒害機(jī)制和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)早期預(yù)報(bào)重金屬污染提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑 Ca（NO3）2·4H2O、MgSO4·7H2O、CuCl2·2H2O、KNO3、KH2PO4、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、乙二胺四乙酸二鈉、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、濃硫酸、Tris濃鹽酸、甘油、聚乙烯吡咯烷酮K30、考馬斯亮藍(lán)G-250、鄰苯三酚、三氯乙酸硫代巴比妥酸、牛血清蛋白、磷酸、95%乙醇、硫酸銅，所用試劑均為分析純。藜麥種子購(gòu)于靜樂(lè)縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 DKZ-450恒溫震蕩水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）、UNICO UV-2102型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）、LC-4016型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）、HC-2062型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）、BDS-11A電導(dǎo)率儀（上海雷磁新涇儀器有限公司）、FA2204B電子天平（上海精密儀器有限公司）、TD1102型電子天平（余姚市金諾天平有限公司）、YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅儀器有限公司）、SPX-300B-G型光照培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、MCDE090100CF4實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（廈門振源工業(yè)有限公司制造）。

1.1.3 溶液的配置 （1）Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（1L培養(yǎng)液加入的數(shù)量）：大量元素：Ca（NO3）2·4H2O 1.18g、KNO3 0.51g、 MgSO4·7H2O 0.49g、KH2PO4 0.14g。微量元素：H3BO3 2.86mg、MnCl2·4H2O 1.81mg、ZnSO4·7H2O 0.22mg、Na2MoO4·2H2O 0.03mg。每1L營(yíng)養(yǎng)液中加入2mLFe-EDTA溶液（七水硫酸亞鐵2.78g，乙二胺四乙酸二鈉 3.73g，蒸餾水500mL，配置完成后，在黑暗并低溫下儲(chǔ)存）。（2）0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液：稱取Na2HPO4 22.70g、NaH2PO4 4.82g、用蒸餾水配制成1L；（3）0.1mol/L的過(guò)氧化氫溶液：取30%H2O2溶液5.68mL，稀釋至1000mL；（4）0.1mol/L高錳酸鉀（K2MnO4）：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸過(guò)的蒸餾水配制成0.1mol/L的高錳酸鉀溶液，并用草酸鈉溶液標(biāo)定，放置7d后使用；（5）蛋白提取液（每100mL加入的數(shù)量）：Tris-HCl（pH=8.0）15mL、甘油25mL、聚乙烯吡咯烷酮K302g，定容于100mL。（6）0.05mol/LTris-HCl（pH=8.0）：50mL0.1mol/L Tris溶液與29.2mL的0.1mol/L鹽酸，用蒸餾水定容至100mL；（7）考馬斯亮藍(lán)G-250染液：取考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50mL的95%乙醇中，加100mL的85%磷酸混勻，再用蒸餾水定容至1000mL；（8）鄰苯三酚（50mmol/L）：稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存；（9）0.6%硫代巴比妥酸：取0.6g的硫代巴比妥酸，加少量的氫氧化鈉（1mol/L）溶解，再用10%的三氯乙酸定容至100mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取大小均一、飽滿的藜麥種子，先用蒸餾水清洗，再用10%的NaClO消毒20min，然后用蒸餾水洗凈后，30℃溫水浴30min，置于18℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h。每50粒排列于鋪有數(shù)層紗布的培養(yǎng)皿中，共設(shè)置6個(gè)Cu2+濃度梯度，分別為CK（蒸餾水），50、100、150、200μmol/L。每個(gè)濃度處理重復(fù)3次，在20℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12h更換一次處理液。

1.2.2 銅離子脅迫下藜麥種子發(fā)芽指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)中種子發(fā)芽均以胚根露白為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)；第4天測(cè)定其發(fā)芽勢(shì)，第7天測(cè)定其發(fā)芽率，并采用普通直尺測(cè)量其主根長(zhǎng)度和株高。相關(guān)計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率（GP）=前7d種子總發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)[10]；

發(fā)芽勢(shì)（GE）=前4d種子總發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)[10-11]；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt）[12]

式中：Dt為發(fā)芽日數(shù)；Gt為與Dt相應(yīng)的發(fā)芽試驗(yàn)終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)。

活力指數(shù)（vigor index，VI）=GI×第7天正常幼苗平均鮮重[13]

式中：幼苗鮮重為稱取5株幼苗的重量。

1.2.3 生理指標(biāo)測(cè)定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[14]；相對(duì)電導(dǎo)率采用電解質(zhì)外滲法測(cè)定[15]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用Giannopolitis等[16]的方法測(cè)定；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用Aebi[16]的方法；可溶性蛋白含量采用考馬亮斯藍(lán)G-250法測(cè)定[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用Office 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，取P<0.05為顯著相關(guān)，各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅離子脅迫對(duì)藜麥種子的萌發(fā)、株高和主根長(zhǎng)的影響 發(fā)芽率是衡量種子質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)，種子能否正常發(fā)芽是生長(zhǎng)的先決條件[9]。由表1可知，隨著Cu2+濃度的升高，藜麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，除50μmol/L與100μmol/L Cu2+濃度處理下，發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)變化差異不顯著外，其余各處理間變化差異顯著（P<0.05）。低濃度Cu2+（0～100μmol/L）對(duì)藜麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)無(wú)明顯的影響，而高濃度Cu2+（150～200μmol/L）則明顯抑制了種子的發(fā)芽。當(dāng)濃度升高到150μmol/L時(shí)，藜麥種子發(fā)芽率明顯降低，為對(duì)照的91.3%，發(fā)芽個(gè)數(shù)達(dá)到供試種子的50%以上，當(dāng)Cu2+濃度增加到200μmol/L時(shí)，藜麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著降低，僅為對(duì)照的85.8%。在銅離子濃度大于50μmol/L時(shí)能夠明顯的抑制藜麥主根的生長(zhǎng)，當(dāng)銅離子濃度大于100μmol/L時(shí)能夠明顯的抑制植株的生長(zhǎng)。

2.2 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性的影響

2.2.1 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響 在植物體中，黃素氧化酶類的代謝產(chǎn)物常包含H2O2，而H2O2的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用，而過(guò)氧化物酶可以清除H2O2，是植物體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)之一。如圖1所示：在銅離子濃度低于100μmol/L時(shí)，其CAT的活性與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的提高，在高于100μmol/l時(shí)CAT的活性隨著銅離子濃度的增加而增加。

2.2.2 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗超氧化物歧化酶（SOD）的影響 超氧化物歧化酶（SOD）是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可以催化超氧負(fù)離子（O2-）進(jìn)行歧化反應(yīng)，生成氧和過(guò)氧化氫：2O2-+H2→O2+H2O2。如圖2所示：在銅離子濃度低于50μmol/L其SOD的活性與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的增加，而在50～150μmol/L，其活性有明顯的增加，相比對(duì)照組增加了63.2%，在高于150μmol/L時(shí)，其活性增長(zhǎng)變緩。

2.3 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

2.3.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 按表1進(jìn)行操作，待5min后在595nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以A595吸光值為縱坐標(biāo)，牛血清蛋白的數(shù)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

2.3.2 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響 植物在遭受逆境脅迫時(shí)，會(huì)改變一些蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中在重金屬脅迫的條件下會(huì)新合成大量的蛋白質(zhì)以適應(yīng)環(huán)境生長(zhǎng)。表3為不同濃度銅離子脅迫下藜麥幼苗體內(nèi)可溶性蛋白的測(cè)定值。如圖4所示：在銅離子濃度小于150μmol/L其幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白含量與對(duì)照組相比有明顯的影響，在銅離子濃度為150μmol/L時(shí)，其可溶性蛋白含量增加了53.4%；當(dāng)銅離子濃度在150～200μmol/L，其可溶性蛋白含量增加逐漸變緩。

2.4 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗質(zhì)膜的透性以及丙二醛（MDA）含量的影響

2.4.1 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗質(zhì)膜透性的影響 植物細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常代謝起著重要作用。逆境（如重金屬）脅迫強(qiáng)度與膜透性增大的程度有關(guān)。表4為不同濃度銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗質(zhì)膜相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定值。如圖5所示：在銅離子濃度50μmol/L時(shí)，其質(zhì)膜的相對(duì)電導(dǎo)率沒(méi)有明顯的變化，這說(shuō)明在此濃度條件下，對(duì)細(xì)胞膜的損壞程度較低，而在銅離子濃度大于50μmol/L時(shí)，其相對(duì)電導(dǎo)率隨著銅離子濃度的增加而逐漸增加，說(shuō)明在濃度為200μmol/L時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜受損程度較大。

2.4.2 銅離子脅迫對(duì)藜麥幼苗體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響 MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其含量高低可反應(yīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的水平和膜受傷害的程度。表5為不同濃度銅離子脅迫下藜麥幼苗體內(nèi)丙二醛含量的測(cè)定值。如圖6所示：在銅離子濃度50μmol/L時(shí)，其藜麥幼苗體內(nèi)丙二醛（MDA）含量沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明在此濃度條件下，細(xì)胞膜膜脂的氧化程度較低并且質(zhì)膜的損壞程度較低，而在銅離子濃度大于50μmol/L時(shí)，其MDA的含量隨著銅離子濃度的增加而逐漸增加，說(shuō)明在濃度為200μmol/L時(shí)，細(xì)胞膜的膜脂氧化程度較大并且質(zhì)膜受損程度較大。

3 結(jié)論與討論

由本試驗(yàn)研究可知，銅離子對(duì)藜麥的正常生長(zhǎng)影響顯著，隨著營(yíng)養(yǎng)液中銅濃度的升高，藜麥幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和過(guò)氧化物酶活性以及葉片的相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，其原因主要為：銅離子的脅迫對(duì)藜麥的保護(hù)系統(tǒng)造成了一定的損傷，使細(xì)胞膜過(guò)度氧化，并且丙二醛作為細(xì)胞膜氧化的主要產(chǎn)物，因此其含量增加；在正常狀態(tài)下，細(xì)胞膜的電導(dǎo)率是一定的，由于細(xì)胞膜的破壞，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變，如：K+的大量外流，使細(xì)胞膜的相對(duì)電導(dǎo)率增加；由于不同濃度的銅離子在脅迫藜麥幼苗時(shí)使細(xì)胞膜過(guò)度氧化，為了防止其氧化細(xì)胞自身，使其體內(nèi)過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性大大增加，從而抑制細(xì)胞膜的氧化，同時(shí)可溶性蛋白的含量也隨之增加。

主根長(zhǎng)下降的趨勢(shì)大于株高下降趨勢(shì)，其具體原因未知，原因可能為：由于根長(zhǎng)時(shí)間接觸含有不同濃度銅離子的營(yíng)養(yǎng)液，使其受到的抑制要大于地上部分；根對(duì)銅離子的敏感性要大于地上部分；根的保護(hù)系統(tǒng)沒(méi)有葉片的保護(hù)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，在銅離子脅迫時(shí)根的損害程度大于地上部分。

今后，除加強(qiáng)對(duì)“三廢”和不合格農(nóng)藥、化肥的監(jiān)測(cè)外，還應(yīng)該在藜麥栽培上，對(duì)已發(fā)生銅污染的農(nóng)田，采取科學(xué)施用化肥、農(nóng)藥，適當(dāng)增施有機(jī)肥料、無(wú)土栽培等措施，盡力創(chuàng)造適宜藜麥生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境，使其在較多環(huán)境中生存，用來(lái)解決糧食問(wèn)題，并給農(nóng)民帶來(lái)豐厚的收入。

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（責(zé)編：張宏民）