外周血單核細(xì)胞亞型改變?cè)谀X出血進(jìn)展的臨床意義研究

田 力，陳欣欣，孫 淼，滕偉禹*

0 引言

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，發(fā)病率為 3%～14%，急性期致死率高達(dá)40%，致殘率70%以上，多數(shù)幸存者遺留較為嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損[1-2]。系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)是ICH后腦損傷的重要因素，炎性細(xì)胞活化、黏附、聚集于血管內(nèi)皮，釋放大量炎性細(xì)胞因子及黏附分子，加重了ICH后損傷[3]。研究表明，ICH后患者體內(nèi)單核細(xì)胞處于活化狀態(tài)，具有較強(qiáng)的促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌的功能，并通過影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[4]。單核細(xì)胞分為3個(gè)亞群：經(jīng)典型(CD14highCD16-)、中間型(CD14highCD16+)和非經(jīng)典型(CD14lowCD16++)，不同亞群在表型、功能及炎癥活化潛能方面存在明顯差異[5]。中間型單核細(xì)胞活化后能產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，抗原提呈能力增強(qiáng)，促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖，并表達(dá)促血管生成的相關(guān)因子。因此，中間型單核細(xì)胞亞群具有較高的活化炎癥反應(yīng)潛能[6]。本研究擬在外周血水平檢測(cè)患者單核細(xì)胞亞型比例的變化及其在ICH后炎性損傷過程中的作用，探討外周血單核細(xì)胞亞型改變?cè)谀X出血進(jìn)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2015年3月至2017年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科的ICH患者(ICH組)，以及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康檢查的同年齡健康老年人(對(duì)照組)，年齡均≥60歲。ICH組39例，男20例，女19例，年齡59～85歲，平均(64.75±14.76)歲。對(duì)照組男12例，女14例，年齡62～85歲，平均(66.23±12.79)歲，排除既往心腦血管等方面疾病。兩組在年齡、性別構(gòu)成等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

外周血標(biāo)本采集及單核細(xì)胞分選納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合第4屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的腦出血診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)顱腦CT掃描證實(shí)；②起病后24 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非血管性腦卒中、腦動(dòng)脈瘤或血管畸形破裂、腦腫瘤、創(chuàng)傷或血管夾層造成的腦血管破裂出血、炎癥、自身免疫性疾病以及出血或凝血機(jī)制異常導(dǎo)致的腦出血；②患有其他腦血管病及神經(jīng)變性疾??；③合并嚴(yán)重心、肺、肝臟疾病、痛風(fēng)、感染性疾病或惡性腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得參加者知情同意。

1.2 研究方法 分別于ICH后1、3、7 d清晨空腹抽取外周靜脈血3 ml，肝素鈉抗凝，24 h內(nèi)完成流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)。

1.3 主要試劑 異硫氰酸熒光素鼠抗人-CD14、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-cy5.5)鼠抗人-CD16單克隆抗體及同型對(duì)照、莫能霉素、紅細(xì)胞裂解液、破膜/固定劑、緩沖液等試劑(BD)；佛波酯和離子霉素(Sigma)；TNF-α、IL-6抗體(Bio-Rad)；常規(guī)試劑均購自沈陽化學(xué)試劑采購供應(yīng)站。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血中間型單核細(xì)胞亞群 按照說明書方法采用每100 μl外周血加入10 μl異硫氰酸熒光素鼠抗人-CD14+、10 μl葉綠素蛋白偶聯(lián)物鼠抗人-CD16+單克隆抗體，室溫避光孵育30 min，紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞后，磷酸鹽緩沖液洗滌，500×g離心6 min，棄上清，400 μl磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞。用FACS Canto流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用前向散射光和側(cè)向散射光區(qū)別單核細(xì)胞，以單核細(xì)胞設(shè)門，讀取單核細(xì)胞分型比例。

1.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞亞群細(xì)胞因子平均熒光強(qiáng)度 按照說明書方法，每100 μl外周血加入50 ng/ml佛波酯、1 μg/ml離子霉素和2.0 μmol/L莫能霉素，刺激培養(yǎng)4 h，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞后，磷酸鹽緩沖液洗滌，500×g離心6 min,棄上清，100 μl磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞。加入10 μl異硫氰酸熒光素鼠抗人-CD14+、10 μl葉綠素蛋白偶聯(lián)物鼠抗人-CD16+，室溫避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，加入500 μl破膜/固定劑，室溫避光孵育20 min，緩沖液洗滌并重懸，100 μl細(xì)胞懸液中加入10 μl藻紅蛋白-鼠抗人TNF-α或 IL-6抗體，室溫避光孵育30 min。磷酸鹽緩沖液洗滌，400 μl磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞。以中間型單核細(xì)胞設(shè)門，讀取TNF-α和IL-6的平均熒光強(qiáng)度。

1.6 ELISA方法檢測(cè)血清細(xì)胞因子濃度 取外周血2 ml，500×g離心5 min，收集血清，-80 ℃冰箱凍存。按試劑說明書方法檢測(cè)TNF-α、IL-6濃度。

2 結(jié)果

2.1 ICH后患者外周血單核細(xì)胞向中間型極化 與對(duì)照組比較，ICH后1、3、7 d中間型及非經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群比例均明顯增加(P<0.01)，3 d時(shí)增加更顯著；而經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群比例在ICH后1、3、7 d顯著下降(P<0.01)。見表1。

2.2 ICH后患者外周血中間型單核細(xì)胞內(nèi)炎性因子含量比較 與對(duì)照組比較，ICH后3、7 d外周血中間型及非經(jīng)典型單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α和IL-6 平均熒光強(qiáng)度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 ICH后患者血清細(xì)胞炎性因子濃度比較及其與中間型單核細(xì)胞比例的相關(guān)性 ICH后3、7 d患者血清濃度高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。ICH后3、7 d患者中間型單核細(xì)胞亞群比例與血清 IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)(r3d=0.397、0.325,r7d=0.308、0.362，P<0.05)。

3 討論

考慮到全血更能代表機(jī)體內(nèi)自然狀況，本研究采用全血細(xì)胞直接檢測(cè)，也避免了先分離單個(gè)核細(xì)胞過程中可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異?；罨a(chǎn)生的影響。研究結(jié)果顯示，與同年齡健康對(duì)照者相比，ICH組患者ICH后1、3、7 d中間型及非經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群比例均有明顯升高，其中ICH后3 d時(shí)升高更顯著；同時(shí)經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群比例在ICH后各時(shí)間點(diǎn)均有下降，這一結(jié)果符合目前關(guān)于系統(tǒng)免疫反應(yīng)參與了腦卒中后損傷的觀點(diǎn)[7-9]。但中間型單核細(xì)胞在ICH后的活化情況及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

外周血中間型單核細(xì)胞比例增加可能是自身免疫性和感染性疾病的普遍現(xiàn)象[10-12]，單核細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化及腦炎等多種自身免疫性疾病、神經(jīng)變性疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用，其中單核細(xì)胞活化分型后異常分泌致炎因子是重要環(huán)節(jié)[13]。在中樞系統(tǒng)疾病中，單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞活化后更易于穿越血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，從而更多地參與疾病進(jìn)展，為疾病的治療提供了靶點(diǎn)，因此，探討ICH后炎性損傷機(jī)制，從而尋找能有效降低炎癥反應(yīng)、減輕腦組織損傷的治療措施是本研究的目的。

本研究還顯示，與健康對(duì)照者相比，患者ICH后3、7 d外周血中間型及非經(jīng)典型單核細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α、IL-6 平均熒光強(qiáng)度升高，表明單核細(xì)胞活性明顯增加分泌高濃度的促炎細(xì)胞因子[14]。同時(shí)患者ICH后3、7 d血清TNF-α、IL-6濃度高于對(duì)照組。TNF-α和IL-6均屬于致炎細(xì)胞因子，主要作用是通過參與機(jī)體炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)通路。病理情況下血清TNF-α、IL-6水平與心肌功能損害程度具有一定的相關(guān)性[15-16]；腦血管病患者急性期血清TNF-α、IL-6水平均明顯增高。TNF-α主要產(chǎn)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等，可將中性粒細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等有效激活，誘導(dǎo)IL-6、一氧化氮(NO)產(chǎn)生，導(dǎo)致人體血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞、通透性增加，引發(fā)微循環(huán)障礙。進(jìn)一步的研究顯示，患者ICH后3、7 d中間型單核細(xì)胞亞群比例與血清 IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)，與目前研究結(jié)果基本一致[17]。

表1 兩組患者外周血單核細(xì)胞亞型變化[M(P25～P75)，%]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

表2 兩組患者外周血中間型單核細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α平均熒光強(qiáng)度及血清濃度比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

綜上所述，本研究表明，ICH后急性期外周血中間型單核細(xì)胞比例升高，并分泌較多的促炎細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α)，參與ICH后的炎性損傷過程。據(jù)此可以得出以下結(jié)論，調(diào)控ICH患者急性期單核細(xì)胞向中間型極化，或阻斷中間型單核細(xì)胞分泌致炎因子，可能成為抑制ICH后炎性損傷的新途經(jīng)，但患者ICH后中間型單核細(xì)胞活化的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示，外周血生物標(biāo)本比較容易采集，根據(jù)患者外周血單核細(xì)胞亞型比例與炎性因子相關(guān)性變化可能作為疾病預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)之一，具有潛在的臨床意義。

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