HPLC-ELSD法測(cè)定腸腑康膠囊A中黃芪甲苷的含量

張 鑫，楊智峰，謝志民*

0 引言

腸腑康膠囊A是陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目資助開發(fā)的純中藥制劑，由黃芪、黨參、炒白術(shù)、炒山楂、茯苓、干姜、木香、炒薏苡仁、制薏苡仁、陳皮、甘草等提取精致組成，具有健脾益氣、止瀉解毒的功效，主要用于治療由于脾虛氣滯導(dǎo)致的潰瘍性結(jié)腸炎等[1]。本課題組曾報(bào)道了腸腑康膠囊的提取工藝研究[2-3]和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中山楂、薏苡仁和甘草的薄層鑒別等[4-5]，尚未建立含量控制項(xiàng)目。鑒于黃芪為方中君藥，主要活性成分為多糖類和黃芪甲苷類，其中黃芪甲苷[6-7]具有抗病毒、保護(hù)心肺、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的作用，與其在本制劑中的藥理作用一致。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]和《中國藥典》[10]，建立HPLC-ELSD法測(cè)定腸腑康膠囊A中黃芪甲苷含量的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本Shimadzu儀器公司)；PL-ELS2100蒸發(fā)光檢測(cè)器(英國Polymer Laboratories公司)，BT124S、BT25S型電子天平(德國賽多利斯)，KQ-700VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；腸腑康膠囊A(陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑，規(guī)格：0.38 g，批號(hào)：20170310、20161116、20161230)；黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-201314，含量95.8%)購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定使用；氮?dú)鉃楦呒兊獨(dú)?純度≥99.999%)，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Welch UltimateXB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-水(38∶62)；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃，漂移管溫度83 ℃，霧化溫度55 ℃，氮?dú)庾鳛檩d氣，流速2.5 ml/min。進(jìn)樣量：對(duì)照品溶液5、15 μl，供試品溶液15 μl。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品5.16 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得(每1 ml含0.516 mg)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取腸腑康膠囊A樣品(批號(hào)：20170310)50粒內(nèi)容物，研勻，取約7.8 g(含黃芪約3 g)，精密稱定，置具塞三角瓶中，加甲醇40 ml，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，濾過，藥渣再加甲醇超聲洗滌3次，每次10 ml/5 min，合并濾液，回收溶劑并濃縮至干；殘?jiān)铀?0 ml，微熱使溶解；用水飽和的正丁醇振搖提取5次(20、20、20、15、15 ml)，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的1%氫氧化鈉溶液充分洗滌2次，每次40 ml，堿液合并，用水飽和的正丁醇20 ml振搖提取，合并正丁醇液；用水洗滌2次，每次20 ml，水液合并，用水飽和的正丁醇20 ml振搖提取，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液3、6、9、12、15、17 μl，各進(jìn)樣2次，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以峰面積平均值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量質(zhì)量(μg)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程Y=1.553 2 X+4.723 5，r=0.999 6，表明黃芪甲苷進(jìn)樣量在1.48～8.40 μg時(shí)，峰面積對(duì)數(shù)與進(jìn)樣量對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液3、10、17 μl，各進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD分別為0.22%、0.34%、0.16%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)20170310的樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，然后按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積并按照兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為0.234 2 mg/g，RSD為3.21%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別在0、1、2、4、8、16、24 h測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.88%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 干擾實(shí)驗(yàn) 按照處方工藝和處方量，制備缺黃芪藥材的陰性樣品，精密稱取粉末7.8 g，置具塞錐形瓶中，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成陰性對(duì)照液。按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定色譜圖，并與供試品和對(duì)照品色譜圖比較，結(jié)果缺黃芪的陰性樣品色譜中，在與黃芪甲苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上未見色譜峰，表明處方中其他藥味對(duì)黃芪甲苷的含量測(cè)定無干擾。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品11.56 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(0.46 mg/ml)。取本品20170310批次內(nèi)容物約38 g，研勻，精密稱取3.9 g，共9份，置具塞錐形瓶中，3份為1組，分別精密加入上述黃芪甲苷對(duì)照品溶液1、2、3 ml，加入甲醇40 ml，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批腸腑康膠囊A樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。見表2。

3 討論

3.1 供試品制備方法選擇 本次實(shí)驗(yàn)首先比較了樣品甲醇超聲提取液蒸干、水溶后，分別用正丁醇提取及堿洗、直接過大孔吸附樹脂柱以及用正丁醇提取、堿洗、過大孔吸附樹脂柱提取的凈化效果。結(jié)果顯示，以正丁醇提取、堿洗、過大孔吸附樹脂柱凈化效果最好，但峰面積稍小；正丁醇提取、堿洗提取效果最好，峰面積最大，而脂溶性雜質(zhì)較多，但在上述色譜條件下不影響黃芪甲苷的測(cè)定。故確定采用正丁醇提取、堿洗的方法制備供試品溶液。接著采用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)正丁醇提取次數(shù)(3、4、5次)、堿洗次數(shù)(2、3、4次)和水洗滌次數(shù)(2、3、4次)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，正丁醇提取次數(shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果有顯著性影響，堿洗次數(shù)有影響但不顯著，水洗滌次數(shù)無影響，因此，確定正丁醇提取次數(shù)5次、堿洗和水洗2次為最佳提取工藝。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 三批樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果

3.2 檢測(cè)器條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)蒸發(fā)光檢測(cè)器的氣化溫度、霧化溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，當(dāng)氣化溫度升高至90 ℃以上時(shí)，峰形特別尖銳，出現(xiàn)直角峰，基線噪音全無，峰面積較??；當(dāng)氣化溫度降為83 ℃、霧化為55 ℃時(shí)，峰形較好，噪音峰出現(xiàn)，峰面積最大，分離度>1.5，峰形對(duì)稱。因此確定蒸發(fā)光檢測(cè)器的氣化溫度為83 ℃、霧化溫度為55 ℃。

3.3 系統(tǒng)適用性的考察 采用同一供試品溶液在不同流速(0.8～1.2 ml/min)、不同乙腈-水的流動(dòng)相比例(34∶66～42∶58)和不同色譜柱(Welch Materials Inc，Agilent5TC-C18，Welch ultimate XBC-C18，Boston Green SOD，資生堂Capcell Pak C18)條件下測(cè)定色譜圖，比較色譜峰分離度、理論塔板數(shù)、不對(duì)稱度和拖尾因子，結(jié)果表明，流速在0.8～1.2 ml/min范圍內(nèi)、流動(dòng)相比例在34∶66～42∶58范圍內(nèi)黃芪甲苷分離完全、峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)最低為4 953，不同廠家色譜柱均能夠使黃芪甲苷分離良好、峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)最低為3 604，因此，建立的方法可以用于腸腑康膠囊中黃芪甲苷的含量測(cè)定。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-ELSD法測(cè)定腸腑康膠囊A中黃芪甲苷的含量具有測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可控性好、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，可以用于腸腑康膠囊A的質(zhì)量控制，為提高和修訂腸腑康膠囊A的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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