大豆粕制備復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅研究

解成駿，黃 超，徐懷春

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

在動(dòng)物體內(nèi)，特定的金屬離子Mn+必須在小腸處與相應(yīng)特定的L-α-AA螯合，形成特定L-α-AA-M，才能被小腸吸收，穩(wěn)定進(jìn)入細(xì)胞中，進(jìn)入細(xì)胞后，特定L-α-AA-M在細(xì)胞中在酶的作用下裂解形成特定的L-α-AA與特定的金屬離子Mn+才能分別被利用[1]。微量元素氨基酸金屬螯合物L(fēng)-α-AA-M獨(dú)特的生化特性、吸收方式、代謝途徑、安全性均優(yōu)別于無機(jī)微量元素，具有較高的生物學(xué)效價(jià)，有益于動(dòng)物的吸收利用。

特定的L-α-AA、特定的L-α-AA-M制品是合成動(dòng)物、人體體液及各種臟器細(xì)胞的重要原料，由于具有特殊結(jié)構(gòu)而具有特殊的營(yíng)養(yǎng)、生理、生化等多種作用，且能全部被吸收，因此特定的L-α-AA、特定的L-α-AA-M制品高效、全能，廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、飼料等行業(yè)，前景廣泛[2-4]。

大豆、花生等中含有18種氨基酸，其中人體或動(dòng)物體不能合成或合成速度及數(shù)量不能滿足正常生長(zhǎng)需要的8種必須氨基酸都有，豆類中含蛋白質(zhì)20%～30%，與肉類中所含的蛋白質(zhì)比例相近，大豆、花生等中構(gòu)成蛋白質(zhì)L-α-AA豐富且含量高。大豆粕含粗蛋白40%以上，以大豆粕為原料，制備L-α-氨基酸、L-α-氨基酸金屬螯合物，可綜合利用大豆粕等富含蛋白質(zhì)的廢棄物，變廢為寶，具有廣闊的應(yīng)用前景[5]。

文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院申請(qǐng)的“用大豆餅或花生粕中制備L-α-氨基酸金屬螯合物”項(xiàng)目（云南省教育廳2014年應(yīng)用研究項(xiàng)目2014Y475）研究如何改變傳統(tǒng)生產(chǎn)L-α-氨基酸、L-α-氨基酸金屬螯合物的方法、表征、工藝控制困難、產(chǎn)率低的問題。

大豆粕或花生粕是榨取了油脂的副產(chǎn)物，已經(jīng)除去了油脂等，其主要成分為粗蛋白，不同原料中蛋白質(zhì)的含量、構(gòu)成蛋白質(zhì)的L-α-氨基酸組成、含量不同。具有特定立體體結(jié)構(gòu)的L-α-氨基酸，與特定的金屬離子螯合（也作為催化劑使用)[5-6]的能力各異，設(shè)計(jì)把大豆粕（蛋白質(zhì)）原料特征水解，先把蛋白質(zhì)立體空間結(jié)構(gòu)中的縱向聯(lián)接被解離而得直鏈蛋白質(zhì)的同時(shí)加入金屬離子，金屬離子可把直鏈蛋白質(zhì)分子中的L-α-氨基酸的基團(tuán)結(jié)合拖出而與之螯合成L-α-氨基酸金屬螯合物工藝簡(jiǎn)單，條件易控，產(chǎn)率高，可減少設(shè)備投入，降低能耗，縮短工藝時(shí)間。

本研究以大豆粕等為原料制備合L-α-氨基酸金屬螯合物

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

大豆粕（云南昆明出產(chǎn)）；二水氯化銅（CuCl2·2H2O）（AR，廣東汕頭轉(zhuǎn)寧化工廠）；氫氧化鈉（AR，天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司）；硫酸（98 %）（AR，四川西隴化工有限公司）；無水乙醇（AR，天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司）；甲基紅（AR，中國(guó)上海遠(yuǎn)航化工廠）；溴甲酚綠（AR，天津市化學(xué)試劑三廠）；EDTA（AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；過氧化氫（30 %，AR,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；溴化鉀（AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；冰乙酸 （AR，上海申博化工有限公司）；甲醇（AR，天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司）。

天平（Precisa，XA220A，瑞士生產(chǎn)）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；傅里葉變換紅外光譜儀（日本津島)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；201型回流裝置。

1.2 方法

將大豆粕原料先除油脂和糖等，然后用酸控制特定的pH值，在特定的溫度條件下水解若干時(shí)間后，再通過調(diào)控pH值結(jié)晶、除鹽，制備復(fù)合的L-α-氨基酸金屬螯合物，應(yīng)用IR光譜法進(jìn)行表征，再用配位滴定法測(cè)出其金屬含量等進(jìn)一步表征確定合成物為目標(biāo)產(chǎn)物。

1.2.1 合成

1.2.1.1 復(fù)合L-α-氨基酸的制備

先安裝電磁攪拌回流裝置，然后用電子天平稱取大豆糟粕50 g加入到圓底燒瓶中，用量筒量取3 mol/L硫酸200 mL加入到圓底燒瓶中，設(shè)置溫度為100 ℃加熱，水解8 h左右得到可溶性與不可溶性氨基酸和雜質(zhì)，然后趁熱通過抽濾泵抽濾除去不溶性雜質(zhì)，在濾液中加入3 g活性炭，攪拌脫色10 min，通過抽濾泵抽濾除去活性炭和雜質(zhì)，將濾液調(diào)節(jié)pH值為5～6蒸發(fā)結(jié)晶得粗復(fù)合氨基酸結(jié)晶，將晶體加入到燒瓶中加入冰乙酸回流45 min，通過抽濾泵抽濾除鹽得濾液，然后向?yàn)V液中加入濾液體積8倍的丙酮使之析出得復(fù)合氨基酸結(jié)晶，最后用無水乙醇洗滌2～3次，將晶體干燥得純復(fù)合氨基酸。

1.2.1.2 復(fù)合L-α-氨基酸銅螯合物的合成

將上面制得的復(fù)合氨基酸取6 g溶解在50 mL的水中，再向里面加入3 g氯化銅，滴加3 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)到pH值為8，控制溫度為45 ℃，恒溫反應(yīng)40 min，期間不斷攪拌，然后將濾液冷卻到室溫，通過抽濾泵抽濾除去不溶性雜質(zhì)，再向抽濾到的濾液中加入體積為8倍的甲醇，立刻會(huì)析出大量晶體，然后靜置10 min，通過抽濾泵抽濾，得到復(fù)合氨基酸銅螯合物藍(lán)紫色的晶體，用無水乙醇洗滌2～3次，真空干燥，得到純復(fù)合氨基酸銅螯合物。

1.2.2 表征

1.2.2.1 IR表征

復(fù)合L-α-氨基酸有各自相應(yīng)的特殊結(jié)構(gòu)，同一復(fù)合L-α-氨基酸，結(jié)構(gòu)相同，IR圖譜相同，不同的L-α-氨基酸，結(jié)構(gòu)有差異，IR圖譜也變化，可以利用物質(zhì)IR譜圖的變化來表征合成產(chǎn)物。

復(fù)合L-α-氨基酸與L-α-氨基酸銅螯合物有各自相應(yīng)的特殊結(jié)構(gòu)，兩者結(jié)構(gòu)有差異，IR圖譜也變化，因而可以利用物質(zhì)的IR譜圖的變化來表征合成產(chǎn)物。

復(fù)合L-α-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、合成復(fù)合L-α-氨基酸、合成復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅等IR圖譜的制作：開啟傅里葉紅外變換光譜儀并使室內(nèi)溫度控制在18 ℃至20 ℃，相對(duì)濕度小于65%，制作復(fù)合L-α-氨基酸壓片和溴化鉀產(chǎn)品壓片（標(biāo)品和產(chǎn)品為1 mg，溴化鉀為110至140 mg）。

KBr壓片：取適量干燥后樣品，在瑪瑙研缽中與KBr研成均勻的粉末。將混合研好的粉末適量放在專用模具上，進(jìn)行壓片。

紅外光譜測(cè)定：先進(jìn)行背景掃描，再將壓好的壓片放到紅外光譜儀上進(jìn)行掃描，分別測(cè)定純品復(fù)合L-α-氨基酸在400～4 000 cm-1的紅外光譜。

1.2.2.2 配位滴定測(cè)定目標(biāo)C螯合銅中的銅[7]

稱取0.15 g左右產(chǎn)品（精確至0.1 mg）于250 mL錐形瓶中，加入1mol的硫酸溶液2.0 mL，待產(chǎn)品溶解后，加50 mL蒸餾水，再加入pH=5.4的六亞甲基四胺緩沖溶液20 mL和2～3滴二甲酚橙指示劑，用0.02161 mol/L的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由紫紅色突變?yōu)辄S綠色，30 s內(nèi)不褪色，即為滴定終點(diǎn)，記錄所消耗的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，測(cè)定3次。

產(chǎn)品中銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按下式計(jì)算:

其中，W(Cu)為銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，C(EDTA)為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L），V(EDTA)為滴定消耗EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL），63.55為銅的摩爾質(zhì)量（g/mol），m為產(chǎn)品試樣的質(zhì)量（g）。

測(cè)定出金屬含量，因?yàn)槟軌蚺c金屬螯合的氨基酸也是特征的，故可以推出復(fù)合L-α-氨基酸的含量，從而進(jìn)行生產(chǎn)控制。

如果是單一的L-α-氨基酸金屬螯合物可以測(cè)定金屬含量，可以用薄層色譜法進(jìn)行分離對(duì)比研究、或凱氏定氮法測(cè)定產(chǎn)品中的氮或測(cè)定產(chǎn)品中的碳的含量等，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行確定表征。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備復(fù)合L-α-氨基酸、復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅

2.1.1 復(fù)合L-α-氨基酸

大豆粕50 g和3 mol/L硫酸200 mL加入到圓底燒瓶，設(shè)置溫度為100 ℃，水解8 h左右，加入兩勺活性炭脫色10 min，通過抽濾泵抽濾除質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值為5～6蒸發(fā)結(jié)晶得粗復(fù)合氨基酸結(jié)晶，然后將晶體用冰乙酸回流45 min，丙酮使之析出得灰白色晶體，進(jìn)一步重結(jié)晶，得中間產(chǎn)物復(fù)合L-α-氨基酸，見圖1。

圖1 復(fù)合L-α-氨基酸產(chǎn)品

2.1.2 復(fù)合L-α-氨基酸銅螯合物

6 g的中間產(chǎn)物復(fù)合L-α-氨基酸和3 g氯化銅混合充分混合后，調(diào)節(jié)pH值=8，控制溫度45 ℃，40 min，抽濾,濾液用8倍體積的甲醇結(jié)晶析出藍(lán)紫色晶體，進(jìn)一步重結(jié)晶，得目標(biāo)復(fù)合L-α-氨基酸銅螯合物，見圖2。

圖2 復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅產(chǎn)品

2.2 表征

2.2.1 IR表征

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)L-α-復(fù)合氨基酸（購）的IR圖譜

用IR圖譜制作法平行制作了自購標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合L-α-氨基酸的IR圖譜，重現(xiàn)性較好，取重現(xiàn)性最好的一個(gè)樣進(jìn)行分析，見圖3。

圖3 復(fù)合L-α-氨基酸IR圖譜

2.2.1.2 自制復(fù)合L-α-復(fù)合氨基酸的IR圖譜

用IR圖譜制作法平行制做了產(chǎn)品復(fù)合L-α-氨基酸的IR圖譜，重現(xiàn)性較好，取重現(xiàn)性最好的一個(gè)樣進(jìn)行分析，見圖4。

圖4 自制L-α-復(fù)合氨基酸IR圖譜

標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合L-α-氨基酸IR圖譜（●圖）與產(chǎn)品復(fù)合L-α-氨基酸IR(▲圖)比較

將上面重現(xiàn)性好的自購標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合L-α-氨基酸IR圖與產(chǎn)品復(fù)合L-α-氨基酸IR圖進(jìn)行對(duì)比，初步確定自制產(chǎn)品為目標(biāo)產(chǎn)物復(fù)合L-α-氨基酸,見圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品(●)、合成產(chǎn)品(▲)的L-α-復(fù)合氨基酸的IR圖的比較

從圖5看出，●、▲兩個(gè)IR圖譜幾乎一樣，確定合成中間產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)品為復(fù)合L-α-氨基酸。

2.2.1.3 產(chǎn)物復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅IR圖

用IR圖譜制作法平行制做了產(chǎn)品復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅的IR圖譜，重現(xiàn)性也較好，取重現(xiàn)性最好的一個(gè)樣進(jìn)行分析，見圖6。

圖6 自制復(fù)合L-α-復(fù)合氨基酸螯合銅的IR圖

復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅(○)IR圖與復(fù)合L-α-氨基酸(△)IR圖比較

將上面重現(xiàn)性好的復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅IR圖與復(fù)合L-α-氨基酸IR圖進(jìn)行對(duì)比，初步確定合成目標(biāo)產(chǎn)物不是同一個(gè)，用復(fù)合L-α-氨基酸在控制條件下可以螯合成復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅，也可用其它方法進(jìn)一步佐證表征（見圖7）。

圖7 復(fù)合L-α-復(fù)合氨基酸螯合銅（○）、復(fù)合L-α-復(fù)合氨基酸(△)的IR圖

根據(jù)圖7可知，復(fù)合L-α-氨基酸與銅離子螯合后，主要吸收峰同配體相比發(fā)生了明顯位移，相對(duì)強(qiáng)度也有所改變。復(fù)合L-α-氨基酸在3 116.39-3 044.78 cm-1有較寬的吸收峰，表明復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅中已無O-H鍵。復(fù)合氨基酸在3 367.55 cm-1處的N-H鍵有特征吸收峰，而復(fù)合L-α-氨基酸與銅離子螯合后，其N-H出現(xiàn)在3 261.38 cm-1處，說明螯合物中N-H鍵發(fā)生了明顯的化學(xué)反應(yīng)從而產(chǎn)生紅移；復(fù)合L-α-氨基酸在2 947.09 cm-1處的C-H鍵有特征吸收峰，而復(fù)合L-α-氨基酸與銅離子螯合后，其C-H出現(xiàn)在2 955.59 cm-1處。由于復(fù)合L-α-氨基酸存在氫鍵，而發(fā)生締合作用，使得復(fù)合L-α-氨基酸紅外光譜沒有出現(xiàn)N-H、C-H和O-H特征吸收峰比較弱而被掩蓋。而形成螯合物后，沒有氫鍵作用，螯合物中N-H、C-H和O-H特征吸收峰比較明顯。由于形成環(huán)狀化合物（？）有擠壓作用使得鍵能增強(qiáng)，鍵力常數(shù)增大，像高波數(shù)移動(dòng)，使得N-H、C-H和C=O發(fā)生藍(lán)移。通過以上對(duì)紅外光譜圖的分析進(jìn)一步說明復(fù)合L-α-氨基酸和銅離子已經(jīng)螯合了。

2.2.2 復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅金屬含量測(cè)定

用配位滴定法測(cè)定復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅中銅的含量，記錄所消耗的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，測(cè)定數(shù)據(jù)見表1 。

表1 復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅銅含量的測(cè)定結(jié)果

由表1，得知銅含量的平均值為29.94%，用于生產(chǎn)控制，得到金屬銅的含量就可以推知氨基酸的含量。

L-α-氨基酸中多肽鏈上的4個(gè)N-H鍵與銅離子螯合作用，所以具有非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，若測(cè)定樣品中金屬含量與其理論含量（a%=MCu/MCu（RCHNH2COO）2×100）比較表征研究。劉俊等在研究蛋氨酸銅螯合物合的制備與表征研究時(shí)就應(yīng)用該法測(cè)定了蛋氨酸銅螯合物中銅的含量為17.08 %，理論值為17.53%，（誤差在容量分析的規(guī)定范圍內(nèi)）從而進(jìn)一步確定了其產(chǎn)物為成產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-α-蛋氨酸螯合銅，其分式為 Cu（CH3SCH2CH2CHNHCOO）2[8]。

3 討論

用大豆粕為原料，通過特定溫度下酸水解、純化制備復(fù)合L-α-氨基酸，然后與氯化銅螯合制備復(fù)合L-α-氨基酸螯合銅，并通過對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行IR法表征研究。知曉了目標(biāo)產(chǎn)物，在生產(chǎn)實(shí)際控制過程中，對(duì)L-α-氨基酸進(jìn)行化學(xué)處理，通過簡(jiǎn)單的酸堿滴定，分析氨基羧基的數(shù)目就可以分析測(cè)量L-α-氨基酸；

通過測(cè)定L-α-氨基酸金屬螯合物中金屬的含量、也可以測(cè)知L-α-氨基酸金屬螯合物的含量，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)控制；同時(shí)也可以對(duì)其它L-α-氨基酸金屬螯合物的合成監(jiān)測(cè)提供理論方法意義；還可以為生產(chǎn)優(yōu)化工藝探究提供參考。

該復(fù)合氨基酸金屬螯合物可廣泛用于農(nóng)藥、化肥生產(chǎn)，不但提供緩釋的金屬離子作為殺菌劑、殺蟲劑，更重要的提供了可用的各種氨基酸，解決了無機(jī)鹽的弊端，可以達(dá)到增肥、農(nóng)藥的雙重作用。崔秀明等曾經(jīng)將該類化合物應(yīng)用于三七根腐病的防治應(yīng)用研究，探索了氨基酸金屬螯合物對(duì)三七根腐病的防治效果,通過盆栽、種苗處理和大田試驗(yàn)等表明,氨基酸金屬螯合物對(duì)三七根腐病有較好效果,綜合防效達(dá)73.74%,接近進(jìn)口農(nóng)藥58%瑞毒霉錳鋅可濕性粉劑[9]。該產(chǎn)品也可以進(jìn)一步純化，通過控制恰當(dāng)?shù)牧繛獒t(yī)學(xué)、食品等行業(yè)提供補(bǔ)銅劑，安全性能優(yōu)于無機(jī)補(bǔ)銅劑。

該法制備工藝容易操作、成本低，制得的產(chǎn)品純度較高，其螯合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，制備的L-α-氨基酸與L-α-氨基酸螯合銅容易表征證明，為制備其它復(fù)合L-α-氨基酸金屬螯合物提供可行方法，更可用于生產(chǎn)控制。

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