3種果肉顏色桃原花青素積累

嚴(yán) 娟， 宋志忠， 蔡志翔， 沈志軍， 馬瑞娟， 俞明亮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

原花青素廣泛存在于植物樹(shù)干、葉、花、果和種子中，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和人體動(dòng)物健康均有重要作用[1-2]。通過(guò)對(duì)擬南芥、西班牙三葉草和葡萄等幾個(gè)模式植物的研究，原花青素合成機(jī)制已經(jīng)比較明晰[3]。從苯丙烷途徑開(kāi)始，通過(guò)無(wú)色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase，LAR)和花青素還原酶(Anthocyanidin reductase，ANR)2個(gè)途徑形成原花青素，因此LAR和ANR是直接調(diào)控原花青素單體以及聚合結(jié)構(gòu)單元形成的關(guān)鍵酶基因。

原花青素在果品中含量極為豐富，其生理作用顯得尤為突出[1]。一是可為果樹(shù)防御生物及非生物傷害，保證其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量；二是與果實(shí)品質(zhì)和風(fēng)味密切相關(guān)，賦予鮮食果品果肉以及果汁、葡萄酒等加工產(chǎn)品獨(dú)特的口感；三是原花青素還是影響果品與葡萄酒等儲(chǔ)藏期的關(guān)鍵因素之一；四是相較于果品中維生素和花色素苷等有益成分，其具有更高的抗氧化能力，為人類(lèi)抵御各種疾病。因此，原花青素現(xiàn)已成為研究與培育富含有益成分果品的重要指標(biāo)。

桃[Prunuspersica(L.) Batsch]是全球重要的薔薇科果樹(shù)，栽培廣泛，生產(chǎn)中心國(guó)包括中國(guó)、意大利、西班牙和美國(guó)等。桃種質(zhì)資源豐富，果實(shí)按肉色主要分為白肉桃、黃肉桃、紅肉桃(包括bfbf-基因型和DBF-基因型)3種類(lèi)型[4]。桃果實(shí)富含抗氧化成分，與可可、葡萄酒、茶及蘋(píng)果、草莓等一樣，桃，特別是DBF-基因型紅肉桃果實(shí)中原花青素含量豐富，鮮果中總含量約為 90～700 mg/kg[5]，現(xiàn)已分離出兒茶素和表兒茶素單體以及各種低聚和高聚產(chǎn)物，對(duì)其中主要成分作了定性定量分析[6-7]。桃果實(shí)中原花青素隨發(fā)育期的積累和代謝機(jī)理的相關(guān)報(bào)道甚少，且相關(guān)研究均是以白肉桃為材料[8-10]，紅肉桃和黃肉桃相關(guān)研究尚未涉及，LAR和ANR等關(guān)鍵酶的酶學(xué)特性亦未見(jiàn)報(bào)道。

作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，白、黃、紅3種肉色桃成熟果肉中的原花青素單體兒茶素和表兒茶素含量存在顯著差異[11]。因此，本研究將以瑞光19號(hào)(白肉)、浙金3號(hào)(黃肉)、紅肉大紅袍(DBF-基因型，紅肉)為材料，進(jìn)行3種果肉顏色的桃原花青素積累動(dòng)態(tài)的生理數(shù)據(jù)采集，測(cè)定調(diào)控原花青素合成的關(guān)鍵酶LAR和ANR的酶活力；克隆關(guān)鍵酶編碼基因(LAR、ANR)，并分析其在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)。旨在從生理、生化(酶)和轉(zhuǎn)錄水平解析不同肉色桃原花青素積累動(dòng)態(tài)及其機(jī)制，為探討桃原花青素合成機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及取樣

本研究材料瑞光19號(hào)(白肉)、浙金3號(hào)(黃肉)、紅肉大紅袍(DBF-基因型，紅肉)均取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)南京桃資源圃，按照常規(guī)栽培方法種植，統(tǒng)一田間管理。每個(gè)品種從盛花后30 d開(kāi)始，每隔7 d取1次樣品，每次分別取18個(gè)果，分為3組，稱(chēng)量每個(gè)果實(shí)大小，快速削皮，果肉切碎混合液氮凍存。參照Lombardo等[12]的方法，根據(jù)每個(gè)品種每個(gè)發(fā)育期的果實(shí)大小平均值擬合各桃品種發(fā)育的S曲線(xiàn)(圖1)，確定各品種的果實(shí)發(fā)育階段和樣品點(diǎn)(表1)。

圖1 桃果實(shí)發(fā)育曲線(xiàn)圖Fig.1 The growth curve of peach fruit

表1 桃果實(shí)發(fā)育期采樣點(diǎn)

S1、S2、S3、S4、H分別表示果實(shí)發(fā)育天數(shù)。

1.2 原花青素的提取與測(cè)定

將適量樣品烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過(guò)40目篩之后，稱(chēng)取約0.05 g，加入1.25 ml 60%乙醇提取液，用超聲提取法進(jìn)行提取，超聲功率300 W，破碎5 s，間歇8 s，提取30 min， 12 000 r/min，25 ℃，離心10 min，取上清液，用提取液定容至1.25 ml，待測(cè)。 吸取40 μl待測(cè)液和160 μl工作液(工作液試劑盒購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)，混勻，30 ℃水浴30 min，在酶標(biāo)儀(Berthold TriStar LB941, 德國(guó))上進(jìn)行500 nm 單波長(zhǎng)測(cè)定。以40 μl待測(cè)液和160 μl H2O的混合液為對(duì)照。原花青素含量單位為mg/g(干質(zhì)量，DW)，計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=0.019 4x+0.000 6，R2=0.999

1.3 ANR和LAR的提取和酶活力測(cè)定

取1 g果肉加入等量的PVPP，液氮研磨后加入pH7.4 的 PBS 緩沖液 4 ℃離心，上清液即為粗酶液。參考Xie等[13]和楊琴等[14]的方法，并作一定修改。200 μl 反應(yīng)體系包括 0.1 mol/L的檸檬酸磷酸緩沖鹽(pH6.5)、粗酶液、反應(yīng)底物[其中無(wú)色花青素還原酶的反應(yīng)底物為二氫斛皮素(0.6 mol/L)，花青素還原酶的反應(yīng)底物為矢車(chē)菊素(0.6 mmol/L)]、輔酶NADPH( 2 mmol/L) 和 pH7.0 的 Tris·HCl 緩沖液(0.1 mol/L)，于40 ℃下分別反應(yīng)30 min， 10 倍體積乙酸乙酯終止反應(yīng)，經(jīng)萃取濃縮后，甲醇定容至0.5 ml。在酶標(biāo)儀(Berthold TriStar LB941, 德國(guó))上進(jìn)行280 nm單波長(zhǎng)測(cè)定。利用原花青素標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算相對(duì)酶活力，單位為mg/g(鮮質(zhì)量，F(xiàn)W)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 果肉總RNA的提取和熒光定量PCR

果肉總RNA提取利用EASYapin Plus Plant RNA Kit試劑盒(鐘鼎，RK16-20T)，提取步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度合格后備用。第一鏈cDNA合成采用AMV First Strand cDNA 合成試劑盒(鐘鼎，PC01-50T)，方法參考說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)條件設(shè)置：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。熒光定量RT-PCR引物和內(nèi)參基因參考 Daniela等[9]和Tong等[15]的研究。引物序列(表2)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。熒光定量RT-PCR在ABI 7500型熒光定量PCR儀中進(jìn)行，利用HiScript QRT SuperMix同引物(正反向引物各0.4 μl)和cDNA模板(2 μl)配置20 μl反應(yīng)體系，設(shè)置3次重復(fù)。熒光定量RT-PCR擴(kuò)增條件設(shè)置：擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 30 s；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s循環(huán)45 次，72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。溶解程序?yàn)椋?5 ℃ 0 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表2 熒光定量PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果肉原花青素的積累變化

桃果肉原花青素含量隨果實(shí)發(fā)育的積累變化見(jiàn)圖2。3個(gè)桃品種原花青素含量差異很大，在發(fā)育過(guò)程中含量分布分別為 0.22～0.53 mg/g, DW、0.14～0.34 mg/g, DW 和 0.10～0.90 mg/g, DW；原花青素積累變化趨勢(shì)差異明顯。瑞光19號(hào)含量變化趨勢(shì)呈倒V形，初期較低，在S4時(shí)期急劇積累(P<0.01)，達(dá)到0.53 mg/g, DW，在成熟時(shí)又快速下降，含量為0.22 mg/g, DW。浙金3號(hào)初期含量最高，為0.34 mg/g, DW，S2到S3時(shí)期快速降低(P<0.01)，在果實(shí)發(fā)育的后期含量趨于平穩(wěn)，成熟時(shí)含量為0.15 mg/g, DW。紅肉大紅袍的原花青素含量在果實(shí)發(fā)育前期均處于很低的水平，甚至在S2時(shí)期明顯下降，但隨著果實(shí)發(fā)育，其含量急劇增加，成熟時(shí)達(dá)到最高，高達(dá)0.90 mg/g, DW。在S1時(shí)期，原花青素含量表現(xiàn)為浙金3號(hào)>瑞光19號(hào)>紅肉大紅袍，其中浙金3號(hào)是紅肉大紅袍的2倍(P<0.01)；到了H時(shí)期，原花青素含量則為紅肉大紅袍>瑞光19號(hào)>浙金3號(hào)，紅肉大紅袍是瑞光19號(hào)和浙金3號(hào)的5倍(P<0.01)。

2.2 桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中LAR和ANR的酶活力

LAR和ANR隨桃果實(shí)發(fā)育的酶活力變化見(jiàn)圖3。同一桃品種中LAR和ANR的酶活力大小有差異，但變化趨勢(shì)基本一致；而3個(gè)桃品種之間LAR和ANR酶活力變化趨勢(shì)差異明顯，在發(fā)育不同時(shí)期活力差異大。

瑞光19號(hào)LAR和ANR的酶活力變化趨勢(shì)較一致，均是在S1至S3時(shí)期升高(P<0.05)，在S4時(shí)期急劇升高(P<0.01)，然后急劇下降(P<0.01)；但LAR的酶活力(0.28～0.74 mg/g, FW)在各個(gè)發(fā)育階段均略高于ANR(0.11～0.61 mg/g, FW)。浙金3號(hào)LAR和ANR的酶活力(0.20～0.43 mg/g, FW 和 0.15～0.46 mg/g, FW)和變化趨勢(shì)均基本相同，表現(xiàn)為隨著果實(shí)發(fā)育逐漸降低，H時(shí)期達(dá)到最低(P<0.01)。紅肉大紅袍LAR和ANR的酶活力分別為 0.17～0.36 mg/g, FW和 0.12～0.80 mg/g, FW，除了S1和S2時(shí)期LAR酶活力略高于ANR外，其他時(shí)期，特別是果實(shí)成熟期，ANR酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于LAR；2個(gè)酶的酶活力變化趨勢(shì)也有輕微差異，LAR酶活力在S1至S3時(shí)期沒(méi)有顯著差異，在S4和H時(shí)期則顯著升高(0.01

S1、S2、S3、S4、H見(jiàn)表1。圖2 桃果肉中原花青素含量變化Fig.2 The changes of proanthocyanidin content in flesh of peach

S1、S2、S3、S4、H見(jiàn)表1。圖3 桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中LAR和ANR酶活力Fig.3 The activities of LAR and ANR during fruit development period

在S1時(shí)期，LAR的活性表現(xiàn)為浙金3號(hào)>瑞光19號(hào)>紅肉大紅袍，其中浙金3號(hào)是紅肉大紅袍的2.0倍；到了H時(shí)期，LAR的活力則為瑞光19號(hào)>紅肉大紅袍>浙金3號(hào)。ANR的活力和LAR相似，即在S1時(shí)期，ANR的活力為浙金3號(hào)>瑞光19號(hào)>紅肉大紅袍，浙金3號(hào)的ANR酶活力是瑞光19號(hào)和紅肉大紅袍的5.0倍；到了H時(shí)期，ANR的活力則為紅肉大紅袍>瑞光19號(hào)>浙金3號(hào)，紅肉大紅袍是瑞光19號(hào)的2.5倍、浙金3號(hào)的7.0倍。

2.3 桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中LAR和ANR的基因表達(dá)

定量PCR結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明同一桃品種中LAR和ANR基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量有差異，但變化趨勢(shì)基本一致。瑞光19號(hào)LAR和ANR表達(dá)量均是在S4時(shí)期達(dá)到最高(P<0.05)，然后在H時(shí)期急劇下降(P<0.01)。浙金3號(hào)LAR基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量在S1時(shí)期最高，并在S2時(shí)間急劇降低(P<0.01)，之后，隨著果實(shí)發(fā)育變化不顯著；然而，ANR基因在S1至S4各時(shí)期的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，但顯著高于H時(shí)期(P<0.05)。紅肉大紅袍LAR和ANR表達(dá)量變化趨勢(shì)有輕微差異，LAR基因在S1至S3時(shí)期的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)，但從S4時(shí)期開(kāi)始至H時(shí)期則顯著升高(P<0.01)；ANR基因的表達(dá)水平則隨著果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期而顯著升高，在S4時(shí)期達(dá)到最高水平(P<0.01)。

3個(gè)桃品種之間LAR和ANR表達(dá)量變化趨勢(shì)差異明顯，在發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量差異大。在S1時(shí)期，LAR基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量由高到低依次為浙金3號(hào)>紅肉大紅袍>瑞光19號(hào)，其中浙金3號(hào)LAR的表達(dá)量是紅肉大紅袍和瑞光19號(hào)的2倍(P<0.01)；而在H期，LAR的表達(dá)量由高到低依次為 紅肉大紅袍>瑞光19號(hào)>浙金3號(hào)。然而，ANR的表達(dá)量在S1時(shí)期表現(xiàn)為浙金3號(hào)> 瑞光19號(hào)>紅肉大紅袍，但到H時(shí)期，則恰好相反，表現(xiàn)為 紅肉大紅袍>瑞光19號(hào)>浙金3號(hào)，其中紅肉大紅袍的ANR表達(dá)量約為瑞光19號(hào)和浙金3號(hào)的10倍(P<0.01)。

S1、S2、S3、S4、H見(jiàn)表1。圖4 桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中LAR和ANR基因表達(dá)Fig.4 Relative expression of LAR and ANR during fruit development period

3 討 論

原花青素的相關(guān)研究在其他果品中已非常深入和廣泛，如葡萄[16]、柿子[17]、蘋(píng)果[18]、草莓[19]、杏[20]、黑莓[21]等，相關(guān)報(bào)道涉及原花青素在果實(shí)中的組成和隨發(fā)育期的含量變化，各種栽培措施、激素和貯藏條件對(duì)其組分的影響，生物合成關(guān)鍵酶LAR和ANR的酶學(xué)特性和基因表達(dá)、以及功能驗(yàn)證等。相較而言，桃果實(shí)中原花青素隨發(fā)育期的積累以及代謝機(jī)理研究報(bào)道鮮少，特別是關(guān)于紅肉或黃肉桃果實(shí)中原花青素的積累尚未報(bào)道。

在前人研究中，白肉桃晚蜜隨著果實(shí)成熟，原花青素總量逐漸降低[8]；白肉桃Stark Red Gold和Baifeng的原花青素總量隨著果實(shí)發(fā)育先積累，隨后又逐漸下降[9-10]。本研究以3種肉色桃果實(shí)為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)原花青素在不同肉色桃的果實(shí)發(fā)育過(guò)程中積累趨勢(shì)完全不同。在白肉桃中表現(xiàn)為先升高后降低，在黃肉桃中表現(xiàn)為逐漸下降，說(shuō)明在所試驗(yàn)的白肉桃和黃肉桃中原花青素的積累都伴隨著果實(shí)成熟而降低，這與前人研究結(jié)果一致[8-10]，也與葡萄、草莓和黑莓等其他果品研究結(jié)果相似[21-22]。而DBF-基因型紅肉桃則恰好相反，隨果實(shí)發(fā)育急劇增加，在成熟時(shí)達(dá)到最高，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于白肉桃和紅肉桃。這一結(jié)果在前期研究中也有所體現(xiàn)，即白肉桃和黃肉桃成熟果肉中原花青素單體兒茶素和表兒茶素的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于紅肉桃中兒茶素和表兒茶素的含量[11]。在桃育種實(shí)踐工作中，紅肉桃果實(shí)在口感上普遍存在澀味，這可能與其成熟時(shí)含有大量原花青素有關(guān)。針對(duì)紅肉桃中原花青素有別于在白肉桃、黃肉桃以及其他果品中的積累規(guī)律，其相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)行進(jìn)一步深入研究和探討。

LAR和ANR基因是直接調(diào)控果品原花青素單體以及聚合結(jié)構(gòu)單元形成的關(guān)鍵酶基因[23-24]。具體地，LAR途徑合成2,3-反式黃烷-3-醇，如兒茶素，ANR途徑生成2,3-順式黃烷-3-醇，如表兒茶素。Daniela 等[9]提出CHS、CHI、FSH、DFR、LDOX、UFGT、ANR、LAR、FLS1結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)與原花青素合成有關(guān)，調(diào)控因子PA1對(duì)ANR和LAR的表達(dá)具有調(diào)控作用；而 Zhou等[10]的研究則著重提出調(diào)控因子MYB7調(diào)控LAR基因的表達(dá)，而非ANR。本研究則以3種肉色桃為材料，探討了原花青素積累與關(guān)鍵酶LAR、ANR的酶活力和酶基因表達(dá)量的關(guān)系。結(jié)果表明，在同一材料中，LAR、ANR的酶活力及其編碼基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況與原花青素積累趨勢(shì)一致。本研究結(jié)果很好地證實(shí)LAR和ANR是桃果實(shí)中原花青素合成的關(guān)鍵調(diào)控基因。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在白肉桃和黃肉桃中，LAR的酶活力和基因表達(dá)量與原花青素的積累相關(guān)性更為密切，而在紅肉桃中，ANR與原花青素的積累更為密切，這一結(jié)果可部分解釋嚴(yán)娟等[11]報(bào)道的兒茶素含量在白肉桃和黃肉桃高，而表兒茶素在紅肉桃中高。本研究結(jié)果初步明確了不同果肉顏色的桃原花青素積累與LAR、ANR酶活力及其編碼基因之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步探討桃原花青素合成機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

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