MaASR1基因通過乙烯途徑提高擬南芥抗旱性的作用機(jī)制

張麗麗， 徐碧玉， 劉菊華， 賈彩紅， 張建斌， 金志強(qiáng),2

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?571101； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站/海南省香蕉遺傳育種改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 海口 570102)

環(huán)境的非生物脅迫，如干旱，極端溫度，寒冷，重金屬，或高鹽，嚴(yán)重?fù)p害植物生長和生產(chǎn)力。干旱是最嚴(yán)重的環(huán)境脅迫，超過任何其他環(huán)境因素，嚴(yán)重?fù)p害植物的生長和發(fā)育，限制植物生產(chǎn)和作物的性能[1]。植物激素，如脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)對植物的生長和發(fā)育有廣泛的影響，它們調(diào)節(jié)植物抵御生物和非生物脅迫的保護(hù)性應(yīng)答[2-6]。不同的非生物脅迫和生物脅迫，經(jīng)常通過共享或重疊激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來引發(fā)植物響應(yīng)[7-8]。

乙烯在試驗(yàn)中被證明可以關(guān)閉氣孔[9]，環(huán)境誘導(dǎo)乙烯積累可以導(dǎo)致氣孔關(guān)閉也已經(jīng)被報(bào)道[10]。乙烯應(yīng)答因子ERF類蛋白在植物生長發(fā)育尤其是在植物應(yīng)對非生物脅迫中起著非常重要的作用[11-12]。在早期的研究中發(fā)現(xiàn)來自番茄的乙烯應(yīng)答因子蛋白JERF3 通過調(diào)節(jié)氧化脅迫應(yīng)答來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對干旱、鹽和冷害的耐受力[13]。JERF1和JERF3基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的過量表達(dá)會引起一系列生理和分子的變化，從而增強(qiáng)水稻對干旱和氧化脅迫的耐受力[14]。植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)依賴于參與脅迫感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、及特定脅迫和代謝相關(guān)基因表達(dá)的分子網(wǎng)絡(luò)的激活[15]。研究結(jié)果表明番茄SlERF5在擬南芥對生物和非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[16]。SlERF5基因在番茄中的過量表達(dá)會增強(qiáng)番茄對干旱和高鹽脅迫的耐受力[17]。油菜乙烯應(yīng)答因子BrERF4在擬南芥中的過量表達(dá)可以增強(qiáng)擬南芥對干旱和鹽的耐受力[18]。擬南芥ERF022可以通過乙烯途徑調(diào)節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)[19]，擬南芥ERF1通過結(jié)合不同的順式作用元件來調(diào)節(jié)非生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)[20]。OsEF109可以顯著提高水稻對干旱脅迫的耐受性[21],OsERF3的過表達(dá)改變了對乙烯生物合成的調(diào)控，揭示了乙烯對植株耐旱性的正調(diào)節(jié)作用[22]。

此外有一些ERF類蛋白在植物響應(yīng)脅迫時(shí)發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用，比如擬南芥AtERF4和AtERF7作為轉(zhuǎn)錄抑制因子來調(diào)控ABA的應(yīng)答[23-24]。AtERF7在擬南芥中的過量表達(dá)可以使保衛(wèi)細(xì)胞降低對ABA的敏感性，因此通過氣孔增加了水分的損失，AtERF7在擬南芥中的過量表達(dá)甚至抑制被ABA誘導(dǎo)的基因的表達(dá)從而降低了對干旱脅迫的耐受力[23]。AtERF4與AtERF7發(fā)揮調(diào)控作用的原理相似，它可以增強(qiáng)植物對鹽脅迫的敏感性[24]。

MaASR1是從香蕉果實(shí)的cDNA文庫中獲得的一個(gè)ASR基因，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明香蕉植株在干旱脅迫條件下，MaASR1基因在根部和葉片中的表達(dá)量大幅上升，這說明MaASR1基因主要參與植物在面臨干旱脅迫時(shí)的應(yīng)答反應(yīng)[25]。為了深入研究MaASR1基因在香蕉干旱脅迫中發(fā)揮作用的抗性機(jī)制，將MaASR1基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因純合株系L14[25]。L14在干旱脅迫條件下的存活率優(yōu)于野生型擬南芥植株[25]。并且在轉(zhuǎn)基因株系中，MaASR1基因的表達(dá)量越大，則該株系表現(xiàn)出來的抗旱能力則越強(qiáng)[25-26]。這些證據(jù)都能說明MaASR1基因的轉(zhuǎn)入能夠提高擬南芥的抗旱性[25]。為了進(jìn)一步研究MaASR1基因轉(zhuǎn)入擬南芥后增強(qiáng)其抗旱性的分子機(jī)制，運(yùn)用DNA芯片技術(shù)來篩選野生型擬南芥和轉(zhuǎn)MaASR1基因擬南芥在不做任何處理和干旱脅迫處理?xiàng)l件下的差異基因，希望能進(jìn)一步解析香蕉MaASR1基因通過乙烯途徑提高擬南芥抗旱性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana. Columbia ecotype)是從美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心購買的。轉(zhuǎn)MaASR1基因的轉(zhuǎn)基因型擬南芥命名為L14，是由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建植物表達(dá)載體后通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化得到的。

1.2 所用引物

本研究所用引物見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對野生型和MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的干旱處理 在MS固體培養(yǎng)基上播種野生型擬南芥WT和MaASR1轉(zhuǎn)基因株系L14的種子，4 ℃條件下處理3 d (該步驟主要是對種子進(jìn)行春化處理)，然后在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。溫度為 21～23 ℃，每日光照和黑暗培養(yǎng)時(shí)間分別為8 h和16 h。光照度為2 000 lx，相對濕度為70%。15 d后，選擇生長出 2～4片葉片的幼苗，將其從培養(yǎng)皿中取出，置于蓋有2個(gè)培養(yǎng)皿的濾紙之上，然后在光照培養(yǎng)箱中模擬干旱脅迫條件進(jìn)行處理。處理時(shí)間分別為0 h、2 h和6 h，然后分別取樣0.2 g，擬南芥的取樣部位為整個(gè)擬南芥幼苗植株，在液氮中冷凍之后于-70 ℃保存[25]。

表1 本研究所用引物

1.3.2 野生型和MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片總RNA的提取及cDNA的合成 取干旱處理0 h、2 h和6 h的試驗(yàn)材料，用QIAGEN plant RNA Kit試劑盒來提取擬南芥的總RNA。然后用Fermentas的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第1條鏈。熒光定量PCR的引物序列見表1，qRT-PCR儀器型號為Mx3000P(Stratagene，USA)，以擬南芥看家基因AtActin(基因登錄號AK318637)為內(nèi)參基因。熒光定量PCR程序?yàn)?4 ℃，30 s；94 ℃ 7 s，55 ℃(57 ℃) 15 s，72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件完成，利用DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,差異顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

1.3.4 表達(dá)譜芯片的制作和分析 提取MaASR1轉(zhuǎn)基因株系(編號為L14)和野生型擬南芥的總RNA，委托博奧生物有限公司制作2種類型的表達(dá)譜芯片，一種是轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥在自然狀態(tài)即未作任何脅迫處理?xiàng)l件下的DNA芯片，命名為14 vs WT，其中14代表非脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系L14，WT代表非脅迫處理下野生型擬南芥；另一種是干旱處理2 h的MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥L14與野生型表達(dá)譜芯片，命名為Y vs W，其中Y代表干旱脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系L14，W代表干旱脅迫處理下野生型擬南芥。2種類型的芯片各重復(fù)3次以減少誤差。并對所得到的DNA芯片的結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析和差異基因的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)譜芯片差異基因的通路分析

表達(dá)譜芯片的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：Ratio≥2代表表達(dá)上調(diào)大于2倍的基因，Ratio≤0.5代表表達(dá)下調(diào)大于2倍的基因。14 vs WT一共得到747個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因559個(gè)，下調(diào)基因188個(gè)；Y vs W一共得到653個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因256個(gè)，下調(diào)基因397個(gè)[27]。

在14 vs WT芯片中得到的差異基因經(jīng)分析共找到61個(gè)相關(guān)的pathway，主要涉及淀粉和蔗糖的代謝，磷酸戊糖途徑，糖酵解及糖異生，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。共有9個(gè)差異基因參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(表2)，其中8個(gè)差異基因上調(diào)，1個(gè)差異基因下調(diào)。

在Y vs W芯片中得到的差異基因經(jīng)分析共找到58個(gè)相關(guān)的pathway，主要涉及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，光合作用，葉綠素代謝，植物生長節(jié)律等代謝途徑。共有20個(gè)差異基因參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(表3)，其中5個(gè)差異基因上調(diào)，15個(gè)差異基因下調(diào)。

表2 14 vs WT芯片中差異基因的通路分析

表3 Y vs W芯片中差異基因的通路分析

通過對表達(dá)譜芯片進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析(主要包括Network分析，Gene ontology分析以及Pathway分析)，發(fā)現(xiàn)MaASR1基因提高植物抗旱性與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有密切的關(guān)系。本研究重點(diǎn)研究了與乙烯途徑的關(guān)系，經(jīng)分析得到了與乙烯途徑相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基因，分別是：ACO1(ACC OXIDASE 1)，即ACC氧化酶基因；ACS6(1-AMINOCYCLOPROPANE-1- CARBOXYLIC ACID (ACC) SYNTHASE 6)，即ACC合成酶基因；AtERF4(ETHYLENE RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR)，即乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子基因；AtERF5、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13、AtETR2(ETHYLENE RESPONSE 2)，即乙烯受體基因；AtERS2(ETHYLENE RESPONSE SENSOR 2)，即乙烯反應(yīng)傳感蛋白基因；AtEBF2(EIN3-BINDING F BOX PROTEIN 2)，即結(jié)合AtEIN3的F-box蛋白基因；At5g61600(ethylene-responsive element-binding family protein)，即乙烯響應(yīng)結(jié)合元件家族蛋白基因[27]。

2.2 表達(dá)譜芯片中野生型及MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥乙烯應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)

ACS6與ACO1參與乙烯生物合成過程，AtERF4、AtERF5、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子，從AtERF4～AtERF11都參與乙烯介導(dǎo)的信號途徑。利用Real-time RT-PCR檢測野生型及MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥不同時(shí)間的干旱處理及在不做任何脅迫處理?xiàng)l件下乙烯相關(guān)基因的表達(dá)變化，來進(jìn)行芯片結(jié)果的驗(yàn)證。

如圖1所示，參與乙烯生物合成途徑的AtACS6和AtACO1，MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h時(shí)的基因表達(dá)量均高于野生型，而在干旱脅迫6 h時(shí)野生型擬南芥基因的表達(dá)量則明顯高于MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥。

參與乙烯信號途徑的ERF類基因，AtERF6、AtERF11和AtERF13基因變化趨勢相同，MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h、6 h時(shí)的基因表達(dá)量均高于野生型；AtERF5和AtERF8基因變化趨勢相同，在未受干旱脅迫時(shí)MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因表達(dá)量明顯高于野生型，在干旱脅迫2 h時(shí)MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型基因表達(dá)量基本相同，而在干旱脅迫6 h時(shí)野生型擬南芥基因表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)基因擬南芥；AtERF4基因變化趨勢與前兩類均不同，在未受干旱脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥基因表達(dá)量與野生型差異不顯著，而在干旱脅迫2 h和6 h時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥基因表達(dá)量則明顯高于野生型。

乙烯受體基因AtETR2和AtERS2在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h和6 h時(shí)，MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥基因表達(dá)量都高于野生型。

未受干旱脅迫時(shí)AtEBF2在MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的基因表達(dá)量明顯高于野生型。干旱脅迫2 h和6 h時(shí)的基因表達(dá)量在MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型中沒有顯著差異。

未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h時(shí)，乙烯響應(yīng)結(jié)合元件家族蛋白At5g61600在MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量均高于野生型，在干旱脅迫6 h時(shí)MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)量低于野生型，達(dá)到了極顯著差異。

從表4中芯片檢測數(shù)據(jù)與Realtime-PCR數(shù)據(jù)之間相關(guān)性分析可以看出，相關(guān)系數(shù)均大于0.7，這說明芯片檢測數(shù)據(jù)與Realtime-PCR數(shù)據(jù)是極顯著正相關(guān)的關(guān)系，說明得到的芯片數(shù)據(jù)是可靠的。

3 討 論

AtACS6即ACC合成酶，是整個(gè)乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，SAM在ACC合酶(ACC synthase,ACS)的催化下產(chǎn)生氨基環(huán)丙烷羧酸(1-aminocyclo- propane-1-carboxylic acid, ACC)，ACC在AtACO1即ACC氧化酶的催化下產(chǎn)生乙烯。RT-PCR結(jié)果表明，在干旱脅迫2 h時(shí)，AtACS6和AtACO1在MaASR1轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)水平與野生型相比明顯提高。這表明在干旱脅迫條件下，MaASR1的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥體內(nèi)的乙烯合成水平。

在植物的乙烯反應(yīng)途徑中，第一步是乙烯與受體分子相結(jié)合。在擬南芥中共有5個(gè)乙烯受體，它們表現(xiàn)出功能冗余。多種乙烯受體的存在是乙烯反應(yīng)順利進(jìn)行所必需的，即使其中的一個(gè)受體功能喪失了或者發(fā)生了突變，乙烯反應(yīng)也不受影響。乙烯受體對乙烯反應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用，擬南芥中乙烯反應(yīng)的誘導(dǎo)是由于這些蛋白質(zhì)的失活而不是激活[28]。受體本身處于開啟狀態(tài)，抑制乙烯反應(yīng)，乙烯與受體的結(jié)合使受體關(guān)閉[29]。乙烯缺乏時(shí)，乙烯受體與CTRI結(jié)合，形成ETR-CTRI復(fù)合體，激活CTRI的負(fù)調(diào)控活性, 不產(chǎn)生乙烯反應(yīng)；乙烯存在時(shí)，乙烯與受體結(jié)合，CTRI不能被激活，產(chǎn)生乙烯反應(yīng)。乙烯受體和CTRI都是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控器，乙烯與受體結(jié)合鈍化其負(fù)調(diào)控活性[30]。位于乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游和末端的EIN2、EIN3和ERF1都是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控器[31]。EBF2即結(jié)合EIN3的F-box蛋白，EBF1/ EBF2通過一條泛蛋白/蛋白酶體途徑作用于EIN3蛋白，使EIN3蛋白迅速降解。說明EBF1/ EBF2間接對乙烯反應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用[32]。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)。圖1 野生型及MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥乙烯應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的Realtime-PCR驗(yàn)證Fig.1 The expression profile of ethylene related genes detected by Realtime-PCR in wild-type and the MaASR1 transgenic line L14

表4 芯片數(shù)據(jù)與熒光定量PCR結(jié)果的相關(guān)性

ERFs 類的轉(zhuǎn)錄因子在植物對非生物脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以與順式作用元件DRE/CRT結(jié)合，而DRE/CRT廣泛存在于與植物對干旱、冷害和鹽害等非生物脅迫等密切相關(guān)的功能基因的啟動(dòng)子中。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以通過識別順式作用元件DRE/CRT調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。水稻中ERFs轉(zhuǎn)錄因子TSRF1的過量表達(dá)可以提高水稻的抗旱性[33]；在水稻中克隆和鑒定了4個(gè)ERF類轉(zhuǎn)錄因子OsBIERF1～OsBIERF4，它們都參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答[34]。可溶性糖和脯氨酸是參與植物滲透調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，它們可以增強(qiáng)植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力[35-36]。JERF3基因在水稻中的過量表達(dá)能提高在干旱脅迫下可溶性糖和脯氨酸的積累水平從而抵御干旱[37]。

以上研究結(jié)果都表明，ERFs 轉(zhuǎn)錄因子在植物的非生物脅迫應(yīng)答中具有非常重要的作用。從表達(dá)譜芯片的分析結(jié)果和RT-PCR的結(jié)果顯示，在2 h干旱脅迫條件下AtERF4、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型有明顯的提高，其中AtERF8的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中與野生型相比差異顯著，AtERF4、AtERF6、AtERF11、AtERF13的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中與野生型相比差異極顯著。在2 h干旱脅迫條件下，AtERF5的表達(dá)在野生型和轉(zhuǎn)基因型中沒有明顯變化；但在未進(jìn)行干旱脅迫時(shí)AtERF5的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型有明顯的提高，差異極顯著。以上結(jié)果表明MaASR1可以通過提高AtERF類基因的表達(dá)來賦予擬南芥植物抗旱性。在干旱脅迫條件下AtETR2和AtERS2的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型有所提高，由于乙烯受體有功能冗余，所以乙烯受體AtETR2和AtERS2表達(dá)量的變化不會影響最后的乙烯反應(yīng)。在干旱脅迫2 h時(shí)，乙烯負(fù)調(diào)控因子AtEBF2的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中與野生型沒有明顯差異，在干旱脅迫6 h時(shí)，AtEBF2的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型明顯下降，因此是有利于乙烯反應(yīng)的進(jìn)行。在干旱脅迫2 h時(shí)，乙烯應(yīng)答蛋白基因At5g61600在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量比野生型顯著提高。

目前尚沒有AtASR基因通過調(diào)節(jié)乙烯途徑來提高植物抗旱性的報(bào)道，以上芯片生物信息學(xué)分析以及RT-PCR的研究結(jié)果表明，MaASR1基因可以通過正調(diào)控乙烯反應(yīng)和提高AtERF類基因的表達(dá)來賦予植物抗旱性。并且在干旱脅迫條件下，MaASR1的轉(zhuǎn)入通過提高AtACS6和AtACO1的表達(dá)水平提高了擬南芥體內(nèi)的乙烯合成水平，這為深入解析MaASR1基因提高植物抗旱性的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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