前列化濁丸對慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠的干預(yù)機(jī)制研究

陳膺仲，宮小勇，鄭 偉，薛超輝，李永強(qiáng)

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西 咸陽 712000)

前列腺炎是男性泌尿外科常見疾病之一，基于人群的調(diào)查估計(jì)，中國前列腺炎的發(fā)病率約為8.4%[1]。前列腺炎中最常見的類型是慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis，CNP)，大約占所有慢性前列腺炎的90%。CNP發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床癥狀多樣，患者常表現(xiàn)為骨盆會(huì)陰區(qū)域疼痛難受、排尿不適、性功能障礙及全身癥狀等。目前研究發(fā)現(xiàn)，慢性前列腺炎與機(jī)體免疫密切相關(guān)，而相關(guān)細(xì)胞因子在慢性前列腺炎中的作用一直是近幾年的研究熱點(diǎn)[2]。本研究通過觀察前列化濁丸對CNP大鼠白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)的影響，探討前列化濁丸治療CNP的作用機(jī)制，為臨床治療CNP提供依據(jù)以及新的思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取15周齡雄性、SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量300～350 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2012-003]提供，動(dòng)物飼養(yǎng)房的溫度控制在(23±3.0)℃，相對濕度為55%～66%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 前列化濁丸(藥物組成：蒲公英20 g，敗醬草、赤芍各10 g，丹參、桃仁、川楝子、王不留行、紅花、乳香、澤蘭各6 g；由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院研發(fā)，藥品批準(zhǔn)文號：陜藥制字Z20150029；規(guī)格：每瓶裝36 g，每20丸質(zhì)量約3 g);苯甲酸雌二醇注射液[批號 (2013)220412511]：四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 IL-10 ELISA試劑盒(批號 70-EK3102/2)、TNF-α ELISA試劑盒(批號 88-7340)：武漢賽維爾生物科技有限公司；IL-8酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海通蔚試劑有限公司。

1.4 儀器與設(shè)備 安圖斯2010全自動(dòng)酶標(biāo)儀：上海拜格生物科技發(fā)展有限公司；HF-1200R高速冷凍離心機(jī)：上海江東儀器有限公司；UVS-1漩渦混勻器：南京科航儀器有限公司；ESJ30-5A精密電子天平：沈陽神宇龍騰天平有限公司。

2 方法

2.1 模型制備與給藥 參照文獻(xiàn)[3]復(fù)制動(dòng)物模型，模型組，前列化濁丸低、中、高劑量組大鼠均經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg對大鼠進(jìn)行麻醉，并在麻醉后行去勢手術(shù)，縫合切口并無菌操作后放回鼠籠，密切觀察。于第2日在腹部皮下注射苯甲酸雌二醇0.25 mg/kg，每日1次，連續(xù)30 d。前列化濁丸低、中、高劑量組每日分別給予0.85、1.7、3.4 g/kg(分別相當(dāng)于臨床70 kg成人日用劑量的5、10、20倍)前列化濁丸溶液灌服；空白對照組給予生理鹽水灌胃。按每100 g體質(zhì)量給予藥物溶液2 mL，持續(xù)灌胃30 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 大鼠前列腺組織病理改變 取大鼠前列腺組織，用4%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)切片5～6 μm，然后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，于光鏡下觀察各組大鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)變化。

2.2.2 大鼠前列腺組織內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量 取大鼠前列腺組織，每1 mg加生理鹽水4 μL并剪碎混勻。向試管內(nèi)加入白細(xì)胞稀釋液0.38 mL，然后用移液器吸取上述制好的標(biāo)本20 μL，在試管稀釋液底層輕輕放出，吹打3次混勻，充池，計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)目。

2.2.3 大鼠血清IL-2、IL-8水平測定 取大鼠腹主動(dòng)脈血4 mL，靜置30 min后用離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min，制備血清1.5 mL，隨后分別用IL-2、IL-8 ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清IL-2、IL-8水平。

2.2.4 大鼠前列腺組織TNF-α、IL-10水平測定 取大鼠前列腺組織，每100 mg加生理鹽水1 mL，攪碎前列腺組織并放入混勻器中，制作前列腺組織勻漿。然后將組織勻漿用離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min，取適量上清液，用TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒檢測各組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠前列腺組織病理形態(tài)學(xué)比較 空白對照組大鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)無異常變化，腺泡腔內(nèi)有粉色分泌物，間質(zhì)內(nèi)沒有炎性細(xì)胞浸潤、無血管充血擴(kuò)張。模型組大鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)變化明顯，可見血管擴(kuò)張充血，腔內(nèi)分泌物減少，泡腔明顯變小、狹窄，腺泡上皮呈現(xiàn)乳頭狀增生，間質(zhì)疏松水腫、纖維化且可見大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，表明動(dòng)物模型復(fù)制成功。與模型組比較，前列化濁丸高、中、低劑量組大鼠前列腺炎性反應(yīng)顯著減輕，前列腺組織病變程度均有不同程度的改善。見圖1。

注:A.空白對照組;B.模型組;C.前列化濁丸低劑量組;D.前列化濁丸中劑量組;E.前列化濁丸高劑量組圖1 各組大鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)比較(HE染色,10×10倍)

3.2 各組大鼠前列腺組織內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量比較 與空白對照組比較，模型組大鼠前列腺組織內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，前列化濁丸低、中、高劑量組大鼠前列腺組織內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量均顯著減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠前列腺組織內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 各組大鼠血清IL-2、IL-8水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-2和IL-8水平均顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，前列化濁丸低、中、高劑量組大鼠血清IL-2和IL-8水平均顯著下降(P<0.05)。見表2。

3.4 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-10水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠前列腺組織中TNF-α和IL-10水平均顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，前列化濁丸低、中、高劑量組大鼠前列腺組織中TNF-α和IL-10水平均顯著下降(P<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠血清IL-2、IL-8水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-10水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

CNP發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床癥狀多樣，常表現(xiàn)為骨盆會(huì)陰區(qū)域疼痛不適、排尿不適、性功能障礙及全身癥狀等；某些患者因CNP遷延不愈甚至并發(fā)焦慮、沮喪、煩躁、抑郁等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重影響患者身心健康及正常生活。

目前，國內(nèi)外研究普遍認(rèn)為CNP發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞因子有關(guān)。細(xì)胞因子由炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其參與CNP的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸，與之密切相關(guān)[4]。鄒如政等[5]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以刺激IL-8并進(jìn)而促進(jìn)前列腺炎的發(fā)生發(fā)展。吳偉燕等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α含量升高導(dǎo)致人體疼痛超敏和自發(fā)性疼痛，這可能也是CNP患者骨盆會(huì)陰區(qū)域疼痛不適的潛在原因。IL-10由Th2輔助細(xì)胞亞群產(chǎn)生，能夠抑制單核巨噬細(xì)胞對免疫介質(zhì)的釋放，減少IL-1和TNF-α的釋放且降低其活性。李杰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，患者精液中IL-10濃度與慢性前列腺炎癥狀評分呈正相關(guān)，患者精液中IL-10濃度越高，其疼痛癥狀就越重。IL-8是強(qiáng)效的炎癥趨化因子，其主要作用是幫助誘導(dǎo)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥區(qū)域并且調(diào)節(jié)白細(xì)胞黏附分子表達(dá)[8]。尹靜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8能夠盡早及更準(zhǔn)確地反映CNP病情變化。IL-2能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖和分化，從而加重炎性浸潤與損傷[10]。張亞強(qiáng)等[11]發(fā)現(xiàn)，慢性前列腺炎患者的前列腺液中IL-2含量較健康人明顯增高。綜上所述，IL-2、IL-8、TNF-α、IL-10與CNP的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測CNP大鼠血清IL-2、IL-8水平以及大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10水平以評估前列化濁丸治療CNP的療效，并且探究其作用機(jī)制。

CNP可歸屬于中醫(yī)學(xué)“精濁”“淋證”等范疇[12]，一般采用行氣活血、化瘀止痛、清熱利濕、導(dǎo)濁通淋等方法進(jìn)行治療。前列化濁丸中丹參、紅花、赤芍、王不留行、乳香、澤蘭、桃仁等活血化瘀，川楝子行氣止痛，乳香活血化瘀，敗醬草、蒲公英清熱排毒、利尿散結(jié)，澤蘭、王不留行活血化瘀、利尿通淋。

本實(shí)驗(yàn)采用前列化濁丸對去勢后皮下注射苯甲酸雌二醇注射液導(dǎo)致的CNP大鼠進(jìn)行干預(yù)。與空白對照組比較，模型組大鼠體內(nèi)IL-2、IL-8、TNF-α、IL-10水平均顯著升高(P<0.05)，說明動(dòng)物模型存在炎性反應(yīng)。與模型組比較，前列化濁丸低、中、高劑量組大鼠體內(nèi)IL-2、IL-8、TNF-α、IL-10水平均有不同程度的降低(P<0.05)，說明經(jīng)前列化濁丸干預(yù)后，治療組大鼠前列腺炎性反應(yīng)較模型組改善。此外，研究發(fā)現(xiàn)前列化濁丸可以有效降低CNP大鼠前列腺組織內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量，減輕間質(zhì)疏松水腫及血管充血擴(kuò)張，這提示前列化濁丸對CNP具有較好的治療效果，其作用機(jī)制可能與抑制IL-2、IL-8、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。模型組大鼠體內(nèi)的抗炎性細(xì)胞因子IL-10升高可能是為了抑制IL-2、IL-8、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子的高表達(dá)，是機(jī)體為了維持細(xì)胞因子之間的平衡而發(fā)生的一種自身調(diào)節(jié)，因此各治療組大鼠在接受前列化濁丸灌胃治療后，體內(nèi)IL-2、IL-8、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子水平降低時(shí)，IL-10水平也隨之下降，進(jìn)而達(dá)到平衡狀態(tài)。

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(收稿日期：2017-11-24；編輯：張倩)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of Qianlie Huazhuo Pill on interleukin-2 (IL-2), interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and interleukin-10 (IL-10) in a rat model of chronic nonbacterial prostatitis (CNP) and the mechanism of action of Qianlie Huazhuo Pill in the treatment of CNP.MethodsA total of 50 specific pathogen-free male Sprague-Dawley rats aged 15 weeks were selected and randomly divided into blank control group, model group, and low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups, with 10 rats in each group. Castration and subcutaneous injection of estradiol benzoate were performed to establish a rat model of CNP. The rats in the blank control group were given normal saline by gavage every day, and those in the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups were given the solution of Qianlie Huazhuo Pill by gavage at daily doses of 0.85 g/kg, 1.7 g/kg, and 3.4 g/kg, respectively; the course of treatment was 30 consecutive days for these groups. The rats were sacrificed after 30 days of treatment by gavage, and serum and prostate samples were collected. The histomorphological changes of the prostate were observed, the number of leukocytes in prostate tissue was compared between groups, and the serum levels of IL-2 and IL-8 and the levels of TNF-α and IL-10 in prostate tissue were measured for all groups.ResultsCompared with the model group, the treatment groups had significant improvements in inflammatory response of the prostate and the severity of prostatic lesion. Compared with the blank control group, the model group had a significant increase in the number of leukocytes in prostate tissue (P<0.05); compared with the model group, the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups had a significant reduction in the number of leukocytes in prostate tissue (P<0.05). Compared with the blank control group, the model group had significant increases in the serum levels of IL-2 and IL-8 (P<0.05); compared with the model group, the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups had significant reductions in the serum levels of IL-2 and IL-8 (P<0.05). Compared with the blank control group, the model group had significant increases in the levels of TNF-α and IL-10 in prostate tissue (P<0.05); compared with the model group, the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups had significant reductions in the levels of TNF-α and IL-10 in prostate tissue (P<0.05).ConclusionQianlie Huazhuo Pill has a good clinical effect in the treatment of CNP, possibly by inhibiting the expression of IL-2, IL-8, and TNF-α.

[Keywords] Chronic nonbacterial prostatitis; Qianlie Huazhuo Pill; Interleukin; Tumor necrosis factor