急性髓系白血病患者miR-372的表達(dá)水平及其臨床意義

趙強(qiáng)強(qiáng) 馮建明 李文倩 沈括 陳紹斌 解友邦 趙長明 侯艷

1青海省人民醫(yī)院血液科（西寧810007）；2青海大學(xué)（西寧810016）

急性髓系白血?。ˋML）是一種以造血干細(xì)胞快速增殖為特征的造血干細(xì)胞惡性疾病。AML的主要特征是未成熟細(xì)胞異常積累以及正常造血細(xì)胞受到抑制［1-2］。急性髓系白血病的預(yù)后多變，從幾周生存期到完全緩解期和治愈期［3］。在成人AML患者中，5年無病生存率與年齡密切相關(guān)，其中65歲以上的患者生存率最低［4］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對AML的分類，細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析對于預(yù)測AML患者的緩解和生存率非常重要［5］。然而，由于AML發(fā)展的分子機(jī)制不同，AML患者的預(yù)后仍然難以準(zhǔn)確估計。因此，鑒定新的生物標(biāo)志物將有助于更好地治療AML，并更好地預(yù)測這些患者的化療反應(yīng)。MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼小RNA分子，長度為18～25個核苷酸。miRNA可以通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA的降解或抑制［6］。miRNAs參與多種生理和生物學(xué)功能，如增殖、分化、器官發(fā)生、胚胎發(fā)生和凋亡［7］。此外，各種疾病都表現(xiàn)出miRNAs的異常表達(dá)和失調(diào)，例如肺癌、腎癌和肝臟疾病［8］。在癌基因的異常激活和抑癌基因沉默的過程中，miRNAs的失調(diào)在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。因此，一些研究表明特異性靶向miRNAs可以成為腫瘤治療的潛在靶點［10］。而且，血漿和血清中miRNAs的表達(dá)譜被證實可以作為非侵入性的生物標(biāo)記物來區(qū)分特定類型的癌癥［9］。最近的研究表明了AML患者不同組織，包括血漿中，各種miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生異常。因此，血漿microRNA是診斷AML和評價AML患者預(yù)后的新的生物標(biāo)記物［9-10］。在不同的腫瘤中，miR-372的異常表達(dá)被廣泛報道［11-12］。但是miR-372是否在急性髓系白血病患者中發(fā)生改變尚未有相關(guān)研究。本次研究主要探討miR-372在急性白血病患者的血漿中的表達(dá)情況及其參與AML發(fā)展的可能作用機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年6月至2016年5月在青海省人民醫(yī)院診治的60例急性髓系白血?。ˋML）患者，以及20例正常對照組的血漿樣本，診斷和分型依據(jù)法-美-英（FAB）分組和2008年WHO分組［13］。所有AML患者均為初治患者，無其他惡性腫瘤病史，未接受過抗腫瘤藥物治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷AML的外周血或骨髓原始細(xì)胞≥ 20%；伴有特殊染色體類型 AML 如 t（8；21）（q22；q22）、inv（16）（p13；q22）和 t（16；16）（p13；q22）時，即使原始細(xì)胞數(shù)＜20%，也應(yīng)診斷為AML。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴t（15；17）（q22；q12）的急性早幼粒細(xì)胞白血?。籑DS或MPD轉(zhuǎn)化而來的AML；治療相關(guān)AML。60例AML患者均經(jīng)過骨髓形態(tài)學(xué)、白血病免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等檢查確診，分型：M0 2例、M1 20例、M2 23例、M4 9例、M5 5例、M7 1例。20例正常對照組來自健康志愿者，其標(biāo)本采集均獲得知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。AML患者及正常對照組臨床資料見表1。

表1 AML患者及正常對照臨床資料Tab.1 Clinical data of AML patients and normal controls

1.2 血漿miRNA檢測 500 μL血漿中的總RNA通過miRNeasy提取試劑盒（Cat No.217184，Qiagen，CA，USA）進(jìn)行分離，然后用50 μL的DEPC水進(jìn)行溶解。提取的RNA用Nano-Drop ND-1000吸光光度計（Thermo Fisher scientific，Waltham，USA）進(jìn)行純度檢測。

之后，RNA進(jìn)一步用miScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat No.218161，Qiagen，CA，USA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR被用來進(jìn)一步確定血漿中miR-372的相對含量。具體反應(yīng)體系及程序如下：cDNA模板（2 μL），SYBER Green Master Mix（5 μL，Cat No.218073，Qiagen，CA，USA），前向引物（1 μL），反向引物（1 μL），ddH2O（1 μL）；95 ℃ 15 min，94 ℃15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s（40 ×）。U6做為內(nèi)源性對照，使用 2-ΔΔ（Ct）方法檢測 miR-372 的相對含量。

1.3 293 T細(xì)胞培養(yǎng) HL-60細(xì)胞及293T細(xì)胞（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心）用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基、于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。每2天更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞達(dá)70%～80%豐度時，傳代或用于實驗。

1.4 靶基因預(yù)測 使用生物信息學(xué)軟件Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測 miR-372的靶基因。

1.5 293 T細(xì)胞中pmirGLO-PTEN重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將包含結(jié)合位點的PTEN的3′UTR區(qū)域克隆到雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒pmirGLO中。將293T細(xì)胞種于6孔板中，待細(xì)胞80%融合后，按說明書分別稀釋pmirGLO-PTEN以及empty-pmirGLO，按HiPerFect（QIAGEN）轉(zhuǎn)染試劑試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測 將培養(yǎng)基倒掉，并用1×PBS沖洗細(xì)胞3次，棄掉PBS，在6孔板的毎孔中加入1×被動細(xì)胞裂解液（PLB），在室溫中震蕩15 min，并將裂解液轉(zhuǎn)入1個EP管中。取100 μL熒光素酶分析底物（LARⅡ）加入反應(yīng)管中，然后加入20 μL細(xì)胞裂解液，待熒光分光光度計讀數(shù)結(jié)束后，再加入100 μL Stop&Glo Buffer。計算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較。

1.7 劃痕實驗 將HL-60細(xì)胞以106cells/well接種于6孔板，24 h后，用槍頭在孔中均勻劃出2條距離相同的橫線，并刮掉中間的所有細(xì)胞。用PBS清洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基。之后，將miR-372 inhibitor或者對照NC轉(zhuǎn)染進(jìn)入HL-60細(xì)胞，48 h后，觀察細(xì)胞遷移情況。轉(zhuǎn)染方法按HiPerFect（QIAGEN）轉(zhuǎn)染試劑試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.8 克隆形成能力檢測 取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶吹打成單細(xì)胞，以50細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板。在孵箱中輕輕轉(zhuǎn)動使細(xì)胞分散，2周后，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，棄去上清，PBS洗2次。之后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min。然后用1 mL GIMSA染色液染20 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。肉眼直接計數(shù)，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以±s表示。連續(xù)性計量資料采用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，非連續(xù)性計量資料采用秩和檢驗進(jìn)行多組間比較。ROC曲線分析miR-372是否可以區(qū)分AML患者與健康對照。95%可信區(qū)間，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-372在急性髓系白血病患者外周血中水平明顯升高 本研究對健康對照組和急性髓系白血病患者外周血中的miR-372水平進(jìn)行了Real time PCR檢測。與健康對照組相比，急性髓系白血病患者外周血中miR-372水平顯著升高。

圖1 急性髓系白血病患者外周血中miR-372水平明顯升高Fig.1 MiR-372 levels in peripheral blood of patients with acute myeloid leukemia are significantly elevated

2.2 ROC曲線分析 受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析表明miR-372可以區(qū)分急性髓系白血病患者與健康對照組，曲線下面積為0.912（95%置信區(qū)間：0.819～1.000；P＜0.000 1）。

2.3 PTEN是miR-372的靶基因 TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PTEN的3′非翻譯區(qū)有6個保守的結(jié)合位點（圖3A）。雙熒光素酶報告基因表明，過表達(dá)miR-372可以顯著抑制pmirGLO-PTEN-3′UTR-1，pmirGLO-PTEN-3′UTR-2，pmirGLO-PTEN-3′UTR-3（包含結(jié)合位點3和4），pmirGLO-PTEN-3′UTR-4（包含結(jié)合位點5和6）（圖3B）。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測表明，過表達(dá)miR-372可以抑制PTEN的表達(dá)，而抑制miR-372可以促進(jìn)PTEN的表達(dá)（圖3C和3D）。

圖2 ROC曲線分析表明miR-372可以區(qū)分急性髓系白血病患者與健康對照Fig.2 ROC curve analysis shows that miR-372 can distinguish patients with acute myeloid leukemia from healthy controls

2.4 敲低miR-372抑制HL-60細(xì)胞遷移 本研究在HL-60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-372 inhibitor。結(jié)果表明，在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著降低HL-60的細(xì)胞遷移率（圖4）。

2.5 敲低miR-372抑制HL-60細(xì)胞克隆形成能力 本研究還證實在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著抑制HL-60細(xì)胞的克隆形成能力（圖5）。

3 討論

在早期急性髓系白血病患者中，早期診斷和及時治療可以有效提高患者的生存率［14-15］。因此，積極尋找診斷和治療急性髓系白血病的新的生物學(xué)標(biāo)志物對于有效診斷和治療具有十分重要的意義［16］。在不同的腫瘤和組織，miRNA表達(dá)譜的改變被廣泛發(fā)現(xiàn)。活檢樣本中，進(jìn)一步分析miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些miRNA表達(dá)的異常改變與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［17］。在循環(huán)系統(tǒng)中，如血漿、血清、尿液中，miRNA可以穩(wěn)定存在［17］。因此，越來越多的研究致力于探討miRNA是否可以成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究重點探討了外周血中的miR-372是否與急性髓系白血病的發(fā)展密切相關(guān)。與健康對照組相比，急性髓系白血病患者血漿中miR-372的水平明顯增加。ROC曲線分析表明miR-372可以區(qū)分急性髓系白血病患者與健康對照。這些結(jié)果初步表明，血漿miR-372在急性髓系白血病的發(fā)展中以致癌基因的形式發(fā)揮作用。

圖3 PTEN是miR-372的靶基因Fig.3 PTEN is the target gene for miR-372

圖4 在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著降低HL-60的細(xì)胞遷移率Fig.4 Knockdown of miR-372 in HL-60 cells can significantly reduce the cell migration of HL-60

圖5 在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著抑制HL-60細(xì)胞的克隆形成能力。Fig.5 Knockdown of miR-372 in HL-60 cells significantly inhibited the colony forming ability of HL-60 cells

在不同的腫瘤中，miR-372的異常表達(dá)被廣泛報道［11-12］。例如，miR-372表達(dá)上調(diào)與口腔癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)［11］。而在肝癌腫瘤轉(zhuǎn)移中，miR-372的水平顯著降低［12］。考慮到miR-372可能的致癌作用，筆者進(jìn)一步分析了其相關(guān)靶基因。Tar-getScan預(yù)測分析的結(jié)果表明，PTEN的3′非翻譯區(qū)存在4個可能的保守結(jié)合位點。眾所周知，PTEN是一個十分重要的抑癌基因。因此，我們將這幾個不同位點的3′UTR區(qū)克隆到雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO中。雙熒光素酶報告基因及Western blot的結(jié)果均表明，PTEN是miR-372的靶基因。因此，我們推測，急性髓系白血病患者血漿中miR-372的升高，可以通過抑制PTEN的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的惡性侵襲和轉(zhuǎn)移。

基于以上推測，筆者進(jìn)一步在急性髓系白血病細(xì)胞HL-60中敲低了miR-372的表達(dá)，從而觀察其對HL-60細(xì)胞遷移和克隆形成能力的影響。本研究結(jié)果表明，在HL-60細(xì)胞中抑制miR-372可以有效抑制細(xì)胞的遷移和克隆形成能力。提示miR-372可能成為急性髓系白血病治療的一個新的潛在靶點。

但是，本研究仍然存在一些缺陷。首先，本研究中所采用的樣本數(shù)目相對較少。其次，在惡性程度不同的急性髓系白血病患者血漿中，miR-372的水平如何變化仍然需要進(jìn)一步的探討。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)，在急性髓系白血病患者血漿中，miR-372水平顯著升高。通過靶向抑癌基因PTEN，miR-372可能成為一個潛在的篩查和診斷急性髓系白血病的非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物。

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