• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    急性髓系白血病患者miR-372的表達(dá)水平及其臨床意義

    2018-07-05 07:01:46趙強(qiáng)強(qiáng)馮建明李文倩沈括陳紹斌解友邦趙長(zhǎng)明侯艷
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2018年12期
    關(guān)鍵詞:血漿

    趙強(qiáng)強(qiáng) 馮建明 李文倩 沈括 陳紹斌 解友邦 趙長(zhǎng)明 侯艷

    1青海省人民醫(yī)院血液科(西寧810007);2青海大學(xué)(西寧810016)

    急性髓系白血?。ˋML)是一種以造血干細(xì)胞快速增殖為特征的造血干細(xì)胞惡性疾病。AML的主要特征是未成熟細(xì)胞異常積累以及正常造血細(xì)胞受到抑制[1-2]。急性髓系白血病的預(yù)后多變,從幾周生存期到完全緩解期和治愈期[3]。在成人AML患者中,5年無病生存率與年齡密切相關(guān),其中65歲以上的患者生存率最低[4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對(duì)AML的分類,細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析對(duì)于預(yù)測(cè)AML患者的緩解和生存率非常重要[5]。然而,由于AML發(fā)展的分子機(jī)制不同,AML患者的預(yù)后仍然難以準(zhǔn)確估計(jì)。因此,鑒定新的生物標(biāo)志物將有助于更好地治療AML,并更好地預(yù)測(cè)這些患者的化療反應(yīng)。MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼小RNA分子,長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸。miRNA可以通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA的降解或抑制[6]。miRNAs參與多種生理和生物學(xué)功能,如增殖、分化、器官發(fā)生、胚胎發(fā)生和凋亡[7]。此外,各種疾病都表現(xiàn)出miRNAs的異常表達(dá)和失調(diào),例如肺癌、腎癌和肝臟疾病[8]。在癌基因的異常激活和抑癌基因沉默的過程中,miRNAs的失調(diào)在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。因此,一些研究表明特異性靶向miRNAs可以成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[10]。而且,血漿和血清中miRNAs的表達(dá)譜被證實(shí)可以作為非侵入性的生物標(biāo)記物來區(qū)分特定類型的癌癥[9]。最近的研究表明了AML患者不同組織,包括血漿中,各種miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生異常。因此,血漿microRNA是診斷AML和評(píng)價(jià)AML患者預(yù)后的新的生物標(biāo)記物[9-10]。在不同的腫瘤中,miR-372的異常表達(dá)被廣泛報(bào)道[11-12]。但是miR-372是否在急性髓系白血病患者中發(fā)生改變尚未有相關(guān)研究。本次研究主要探討miR-372在急性白血病患者的血漿中的表達(dá)情況及其參與AML發(fā)展的可能作用機(jī)制。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 研究對(duì)象 選取2015年6月至2016年5月在青海省人民醫(yī)院診治的60例急性髓系白血?。ˋML)患者,以及20例正常對(duì)照組的血漿樣本,診斷和分型依據(jù)法-美-英(FAB)分組和2008年WHO分組[13]。所有AML患者均為初治患者,無其他惡性腫瘤病史,未接受過抗腫瘤藥物治療。納入標(biāo)準(zhǔn):診斷AML的外周血或骨髓原始細(xì)胞≥ 20%;伴有特殊染色體類型 AML 如 t(8;21)(q22;q22)、inv(16)(p13;q22)和 t(16;16)(p13;q22)時(shí),即使原始細(xì)胞數(shù)<20%,也應(yīng)診斷為AML。排除標(biāo)準(zhǔn):伴t(15;17)(q22;q12)的急性早幼粒細(xì)胞白血病;MDS或MPD轉(zhuǎn)化而來的AML;治療相關(guān)AML。60例AML患者均經(jīng)過骨髓形態(tài)學(xué)、白血病免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等檢查確診,分型:M0 2例、M1 20例、M2 23例、M4 9例、M5 5例、M7 1例。20例正常對(duì)照組來自健康志愿者,其標(biāo)本采集均獲得知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。AML患者及正常對(duì)照組臨床資料見表1。

    表1 AML患者及正常對(duì)照臨床資料Tab.1 Clinical data of AML patients and normal controls

    1.2 血漿miRNA檢測(cè) 500 μL血漿中的總RNA通過miRNeasy提取試劑盒(Cat No.217184,Qiagen,CA,USA)進(jìn)行分離,然后用50 μL的DEPC水進(jìn)行溶解。提取的RNA用Nano-Drop ND-1000吸光光度計(jì)(Thermo Fisher scientific,Waltham,USA)進(jìn)行純度檢測(cè)。

    之后,RNA進(jìn)一步用miScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat No.218161,Qiagen,CA,USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR被用來進(jìn)一步確定血漿中miR-372的相對(duì)含量。具體反應(yīng)體系及程序如下:cDNA模板(2 μL),SYBER Green Master Mix(5 μL,Cat No.218073,Qiagen,CA,USA),前向引物(1 μL),反向引物(1 μL),ddH2O(1 μL);95 ℃ 15 min,94 ℃15 s,55 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s(40 ×)。U6做為內(nèi)源性對(duì)照,使用 2-ΔΔ(Ct)方法檢測(cè) miR-372 的相對(duì)含量。

    1.3 293 T細(xì)胞培養(yǎng) HL-60細(xì)胞及293T細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基、于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。每2天更換培養(yǎng)液1次,細(xì)胞達(dá)70%~80%豐度時(shí),傳代或用于實(shí)驗(yàn)。

    1.4 靶基因預(yù)測(cè) 使用生物信息學(xué)軟件Target Scan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè) miR-372的靶基因。

    1.5 293 T細(xì)胞中pmirGLO-PTEN重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將包含結(jié)合位點(diǎn)的PTEN的3′UTR區(qū)域克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pmirGLO中。將293T細(xì)胞種于6孔板中,待細(xì)胞80%融合后,按說明書分別稀釋pmirGLO-PTEN以及empty-pmirGLO,按HiPerFect(QIAGEN)轉(zhuǎn)染試劑試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

    1.6 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè) 將培養(yǎng)基倒掉,并用1×PBS沖洗細(xì)胞3次,棄掉PBS,在6孔板的毎孔中加入1×被動(dòng)細(xì)胞裂解液(PLB),在室溫中震蕩15 min,并將裂解液轉(zhuǎn)入1個(gè)EP管中。取100 μL熒光素酶分析底物(LARⅡ)加入反應(yīng)管中,然后加入20 μL細(xì)胞裂解液,待熒光分光光度計(jì)讀數(shù)結(jié)束后,再加入100 μL Stop&Glo Buffer。計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度,并與空載對(duì)照比較。

    1.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 將HL-60細(xì)胞以106cells/well接種于6孔板,24 h后,用槍頭在孔中均勻劃出2條距離相同的橫線,并刮掉中間的所有細(xì)胞。用PBS清洗3次,加入新鮮培養(yǎng)基。之后,將miR-372 inhibitor或者對(duì)照NC轉(zhuǎn)染進(jìn)入HL-60細(xì)胞,48 h后,觀察細(xì)胞遷移情況。轉(zhuǎn)染方法按HiPerFect(QIAGEN)轉(zhuǎn)染試劑試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

    1.8 克隆形成能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶吹打成單細(xì)胞,以50細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板。在孵箱中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使細(xì)胞分散,2周后,當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí),棄去上清,PBS洗2次。之后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min。然后用1 mL GIMSA染色液染20 min,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。肉眼直接計(jì)數(shù),克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示。連續(xù)性計(jì)量資料采用單因素方差分析進(jìn)行多組比較,非連續(xù)性計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較。ROC曲線分析miR-372是否可以區(qū)分AML患者與健康對(duì)照。95%可信區(qū)間,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-372在急性髓系白血病患者外周血中水平明顯升高 本研究對(duì)健康對(duì)照組和急性髓系白血病患者外周血中的miR-372水平進(jìn)行了Real time PCR檢測(cè)。與健康對(duì)照組相比,急性髓系白血病患者外周血中miR-372水平顯著升高。

    圖1 急性髓系白血病患者外周血中miR-372水平明顯升高Fig.1 MiR-372 levels in peripheral blood of patients with acute myeloid leukemia are significantly elevated

    2.2 ROC曲線分析 受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析表明miR-372可以區(qū)分急性髓系白血病患者與健康對(duì)照組,曲線下面積為0.912(95%置信區(qū)間:0.819~1.000;P<0.000 1)。

    2.3 PTEN是miR-372的靶基因 TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PTEN的3′非翻譯區(qū)有6個(gè)保守的結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告基因表明,過表達(dá)miR-372可以顯著抑制pmirGLO-PTEN-3′UTR-1,pmirGLO-PTEN-3′UTR-2,pmirGLO-PTEN-3′UTR-3(包含結(jié)合位點(diǎn)3和4),pmirGLO-PTEN-3′UTR-4(包含結(jié)合位點(diǎn)5和6)(圖3B)。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)表明,過表達(dá)miR-372可以抑制PTEN的表達(dá),而抑制miR-372可以促進(jìn)PTEN的表達(dá)(圖3C和3D)。

    圖2 ROC曲線分析表明miR-372可以區(qū)分急性髓系白血病患者與健康對(duì)照Fig.2 ROC curve analysis shows that miR-372 can distinguish patients with acute myeloid leukemia from healthy controls

    2.4 敲低miR-372抑制HL-60細(xì)胞遷移 本研究在HL-60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-372 inhibitor。結(jié)果表明,在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著降低HL-60的細(xì)胞遷移率(圖4)。

    2.5 敲低miR-372抑制HL-60細(xì)胞克隆形成能力 本研究還證實(shí)在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著抑制HL-60細(xì)胞的克隆形成能力(圖5)。

    3 討論

    在早期急性髓系白血病患者中,早期診斷和及時(shí)治療可以有效提高患者的生存率[14-15]。因此,積極尋找診斷和治療急性髓系白血病的新的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于有效診斷和治療具有十分重要的意義[16]。在不同的腫瘤和組織,miRNA表達(dá)譜的改變被廣泛發(fā)現(xiàn)。活檢樣本中,進(jìn)一步分析miRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)這些miRNA表達(dá)的異常改變與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。在循環(huán)系統(tǒng)中,如血漿、血清、尿液中,miRNA可以穩(wěn)定存在[17]。因此,越來越多的研究致力于探討miRNA是否可以成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物。

    本研究重點(diǎn)探討了外周血中的miR-372是否與急性髓系白血病的發(fā)展密切相關(guān)。與健康對(duì)照組相比,急性髓系白血病患者血漿中miR-372的水平明顯增加。ROC曲線分析表明miR-372可以區(qū)分急性髓系白血病患者與健康對(duì)照。這些結(jié)果初步表明,血漿miR-372在急性髓系白血病的發(fā)展中以致癌基因的形式發(fā)揮作用。

    圖3 PTEN是miR-372的靶基因Fig.3 PTEN is the target gene for miR-372

    圖4 在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著降低HL-60的細(xì)胞遷移率Fig.4 Knockdown of miR-372 in HL-60 cells can significantly reduce the cell migration of HL-60

    圖5 在HL-60細(xì)胞中敲低miR-372可以顯著抑制HL-60細(xì)胞的克隆形成能力。Fig.5 Knockdown of miR-372 in HL-60 cells significantly inhibited the colony forming ability of HL-60 cells

    在不同的腫瘤中,miR-372的異常表達(dá)被廣泛報(bào)道[11-12]。例如,miR-372表達(dá)上調(diào)與口腔癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)[11]。而在肝癌腫瘤轉(zhuǎn)移中,miR-372的水平顯著降低[12]??紤]到miR-372可能的致癌作用,筆者進(jìn)一步分析了其相關(guān)靶基因。Tar-getScan預(yù)測(cè)分析的結(jié)果表明,PTEN的3′非翻譯區(qū)存在4個(gè)可能的保守結(jié)合位點(diǎn)。眾所周知,PTEN是一個(gè)十分重要的抑癌基因。因此,我們將這幾個(gè)不同位點(diǎn)的3′UTR區(qū)克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因載體pmirGLO中。雙熒光素酶報(bào)告基因及Western blot的結(jié)果均表明,PTEN是miR-372的靶基因。因此,我們推測(cè),急性髓系白血病患者血漿中miR-372的升高,可以通過抑制PTEN的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的惡性侵襲和轉(zhuǎn)移。

    基于以上推測(cè),筆者進(jìn)一步在急性髓系白血病細(xì)胞HL-60中敲低了miR-372的表達(dá),從而觀察其對(duì)HL-60細(xì)胞遷移和克隆形成能力的影響。本研究結(jié)果表明,在HL-60細(xì)胞中抑制miR-372可以有效抑制細(xì)胞的遷移和克隆形成能力。提示miR-372可能成為急性髓系白血病治療的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。

    但是,本研究仍然存在一些缺陷。首先,本研究中所采用的樣本數(shù)目相對(duì)較少。其次,在惡性程度不同的急性髓系白血病患者血漿中,miR-372的水平如何變化仍然需要進(jìn)一步的探討。

    綜上,本研究首次發(fā)現(xiàn),在急性髓系白血病患者血漿中,miR-372水平顯著升高。通過靶向抑癌基因PTEN,miR-372可能成為一個(gè)潛在的篩查和診斷急性髓系白血病的非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物。

    [1]KROWIORZ K,RUSCHMANN J,LAI C,et al.MiR-139-5p is a potent tumor suppressor in adult acute myeloid leukemia[J].Blood Cancer J,2016,6(12):e508.

    [2]XIAO Y,SU C,DENG T.MiR-223 decreases cell proliferation and enhances cell apoptosis in acute myeloid leukemia via targeting FBXW7[J].Oncol Lett,2016;12(5):3531-3536.

    [3]FAVREAU A J,MCGLAUFLIN R E,DUARTE C W,et al.MiR-199b,a novel tumor suppressor miRNA in acute myeloid leukemia with prognostic implications[J].Exp Hematol Oncol,2016,5(1):4.

    [4]HUA J Y,F(xiàn)ENG Y,PANG Y,et al.MiR-181a promotes proliferation of human acute myeloid leukemia cells by targeting ATM[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2016,24(2):347-351.

    [5]HUANG X,SCHWIND S,SANTHANAM R,et al.Targeting the RAS/MAPK pathway with miR-181a in acute myeloid leukemia[J].Oncotarget,2016,7(37):59273-59286.

    [6]JIANG X,BUGNO J,HU C,et al.Eradication of acute myeloid leukemia with FLT3 ligand-targeted miR-150 nanoparticles[J].Cancer Res,2016,76(15):4470-4480.

    [7]LIU X,LIAO W,PENG H,et al.MiR-181a promotes G1/S transition and cell proliferation in pediatric acute myeloid leukemia by targeting ATM[J].J Cancer Res Clin Oncol,2016,142(1):77-87.

    [8]MAHARRY S E,WALKER C J,LIYANARACHCHI S,et al.Dissection of the major hematopoietic quantitative trait locus in chromosome 6q23.3 identifies miR-3662 as a novel player in hematopoiesis and acute myeloid leukemia[J].Cancer Discov,2016,6(9):1036-1051.

    [9]ZHI Y,XIE X,WANG R,et al.Serum level of miR-10-5p as a prognostic biomarker for acute myeloid leukemia[J].Int J Hematol,2015,102(3):296-303.

    [10]SUN X,LIU D,XUE Y,et al.Enforced miR-144-3p expression as a non-invasive biomarker for the acute myeloid leukemia patients mainly by targeting NRF2[J].Clin Lab ,2017,63(4):679-687.

    [11]TU H F,CHANG K W,CHENG H W,et al.Upregulation of miR-372 and-373 associates with lymph node metastasis and poor prognosis of oral carcinomas[J].Laryngoscope,2015,125(11):E365-370.

    [12]WU G,WANG Y,LU X,et al.Low mir-372 expression correlates with poor prognosis and tumor metastasis in hepatocellular carcinoma[J].Bmc Cancer,2015,15(1):1-12.

    [13]BENNETT J,ORAZI A.Diagnostic criteria to distinguish hypocellular acute myeloid leukemia from hypocellular myelodysplastic syndromes and aplastic anemia:recommendations for a standardized approach[J].Haematologica ,2009,94(2):264-268.

    [14]SHI J,LIN F,LI Y,et al.Identification of let-7a-2-3p or/and miR-188-5p as prognostic biomarkers in cytogenetically normal acute myeloid leukemia[J].PloS One,2015,10(2):e0118099.

    [15]SU R,LIN H S,ZHANG X H,et al.MiR-181 family:regulators of myeloid differentiation and acute myeloid leukemia as well as potential therapeutic targets[J].Oncogene,2015,34(25):3226-3239.

    [16]NANBAKHSH A,VISENTIN G,OLIVE D,et al.MiR-181a modulates acute myeloid leukemia susceptibility to natural killer cells[J].Oncoimmunology,2015,4(12):e996475.

    [17]ELHAMAMSY A R,SHARKAWY M S E,ZANATY A F,et al.Circulating miR-92a,miR-143 and miR-342 in plasma are novel potential biomarkers for acute myeloid leukemia[J].Int J Mol Cell Med,2017,6(2):77-86.

    猜你喜歡
    血漿
    糖尿病早期認(rèn)知功能障礙與血漿P-tau217相關(guān)性研究進(jìn)展
    血漿置換加雙重血漿分子吸附對(duì)自身免疫性肝炎合并肝衰竭的細(xì)胞因子的影響
    血漿corin、NEP、BNP與心功能衰竭及左室收縮功能的相關(guān)性
    血漿B型利鈉肽在慢性心衰診斷中的應(yīng)用
    miRNA-145和miRNA-143在川崎病患兒血漿中的表達(dá)及意義
    CHF患者血漿NT-proBNP、UA和hs-CRP的變化及其臨床意義
    自體富血小板血漿在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的潛在價(jià)值
    胰腺癌患者血漿中microRNA-100水平的測(cè)定及臨床意義
    腦卒中后中樞性疼痛相關(guān)血漿氨基酸篩選
    系統(tǒng)性硬化病患者血漿D-dimer的臨床意義探討
    成人特级av手机在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲无线观看免费| 在线精品无人区一区二区三| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品国产av在线观看| 国产在线男女| 99久久精品一区二区三区| 久久狼人影院| 人人妻人人看人人澡| 看免费成人av毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 寂寞人妻少妇视频99o| 一级,二级,三级黄色视频| 观看av在线不卡| 最新中文字幕久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 色哟哟·www| av天堂久久9| 亚洲精品久久午夜乱码| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 91精品国产国语对白视频| 春色校园在线视频观看| 午夜免费鲁丝| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产在线免费精品| 尾随美女入室| 男女免费视频国产| 日本av免费视频播放| 亚洲av.av天堂| 五月玫瑰六月丁香| 大码成人一级视频| 人人澡人人妻人| 99九九在线精品视频 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲人成网站在线播| 免费少妇av软件| 另类亚洲欧美激情| 亚洲国产日韩一区二区| 久久国产精品大桥未久av | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av女优亚洲男人天堂| 欧美成人精品欧美一级黄| 99热这里只有是精品50| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 一级毛片电影观看| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久久久大av| 亚洲怡红院男人天堂| 久久免费观看电影| 一区二区三区精品91| 91久久精品电影网| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 一区二区三区四区激情视频| 国模一区二区三区四区视频| 精品人妻熟女av久视频| 欧美3d第一页| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品一区二区三卡| 超碰97精品在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线观看国产h片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 香蕉精品网在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| av天堂中文字幕网| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩av免费高清视频| 国产成人a∨麻豆精品| 久热久热在线精品观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| a级片在线免费高清观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 成人美女网站在线观看视频| 欧美97在线视频| 亚洲三级黄色毛片| 伊人久久国产一区二区| av线在线观看网站| 日韩电影二区| kizo精华| 亚洲成人av在线免费| 亚洲真实伦在线观看| 日韩大片免费观看网站| 人人澡人人妻人| 国产片特级美女逼逼视频| 国产91av在线免费观看| 在线播放无遮挡| 全区人妻精品视频| 深夜a级毛片| 少妇的逼好多水| 99九九在线精品视频 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| av福利片在线| 99久久精品国产国产毛片| av在线app专区| h日本视频在线播放| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日本黄大片高清| 久久99蜜桃精品久久| 在线观看av片永久免费下载| 中文欧美无线码| 69精品国产乱码久久久| 久久久国产一区二区| 久久97久久精品| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精品aⅴ在线观看| 多毛熟女@视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 成年人午夜在线观看视频| 99久久精品一区二区三区| 国产极品天堂在线| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 婷婷色综合大香蕉| 五月天丁香电影| 午夜视频国产福利| 亚洲怡红院男人天堂| 大香蕉97超碰在线| 不卡视频在线观看欧美| 日韩中文字幕视频在线看片| a级毛色黄片| 亚洲久久久国产精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 啦啦啦啦在线视频资源| 99九九线精品视频在线观看视频| 18禁在线播放成人免费| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产av码专区亚洲av| 亚洲欧洲国产日韩| 国产高清有码在线观看视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美精品亚洲一区二区| 9色porny在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久影院123| 狂野欧美激情性bbbbbb| 三上悠亚av全集在线观看 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| a级毛片在线看网站| 国产成人精品久久久久久| 大陆偷拍与自拍| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 街头女战士在线观看网站| 高清av免费在线| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久久国产电影| 麻豆成人av视频| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲国产欧美在线一区| 丰满少妇做爰视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 少妇高潮的动态图| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美精品一区二区免费开放| 少妇人妻一区二区三区视频| 婷婷色综合大香蕉| 精品一区二区免费观看| 国产精品一区二区在线不卡| 一级二级三级毛片免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 极品教师在线视频| 赤兔流量卡办理| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲高清免费不卡视频| 麻豆乱淫一区二区| av视频免费观看在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产在视频线精品| 日日啪夜夜爽| 亚洲av二区三区四区| 精品国产乱码久久久久久小说| 18禁在线播放成人免费| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日本黄大片高清| 亚洲综合色惰| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲不卡免费看| 嘟嘟电影网在线观看| 成年av动漫网址| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女大奶头黄色视频| 少妇丰满av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 一本一本综合久久| 内地一区二区视频在线| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 各种免费的搞黄视频| 视频中文字幕在线观看| 老司机影院成人| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲成色77777| 亚洲欧洲国产日韩| 一区二区三区乱码不卡18| 丝袜喷水一区| 久久99一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 乱系列少妇在线播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 只有这里有精品99| 国产av国产精品国产| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲三级黄色毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 久久影院123| 国产精品久久久久久久久免| 伦理电影大哥的女人| 亚洲av.av天堂| 国产老妇伦熟女老妇高清| 另类亚洲欧美激情| 日本色播在线视频| 99久久综合免费| 欧美精品高潮呻吟av久久| a级毛片在线看网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99久国产av精品国产电影| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 亚洲不卡免费看| 日韩一本色道免费dvd| 伦理电影免费视频| av女优亚洲男人天堂| 青春草视频在线免费观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产精品国产三级专区第一集| 女人精品久久久久毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 自线自在国产av| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 偷拍熟女少妇极品色| 美女视频免费永久观看网站| 伦理电影大哥的女人| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品久久久久成人av| 免费少妇av软件| 久久热精品热| 国产精品女同一区二区软件| 晚上一个人看的免费电影| 看十八女毛片水多多多| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩成人伦理影院| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 免费看av在线观看网站| 岛国毛片在线播放| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久午夜福利片| 老司机影院成人| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产黄片美女视频| 久久久久视频综合| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 少妇的逼水好多| 中文欧美无线码| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 丝袜喷水一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 最近中文字幕高清免费大全6| 丝瓜视频免费看黄片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产91av在线免费观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美国产精品一级二级三级 | 黑人高潮一二区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 男女国产视频网站| 久久久精品免费免费高清| 少妇人妻久久综合中文| 久久久久久久久久久丰满| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产成人aa在线观看| 熟女电影av网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 97超碰精品成人国产| 97超视频在线观看视频| av在线app专区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 三级国产精品片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一本大道久久a久久精品| av有码第一页| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美人与善性xxx| 欧美国产精品一级二级三级 | 我要看日韩黄色一级片| 亚洲精品一二三| 一边亲一边摸免费视频| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 最后的刺客免费高清国语| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 尾随美女入室| 在线观看美女被高潮喷水网站| 两个人免费观看高清视频 | 青春草视频在线免费观看| 只有这里有精品99| 国产精品久久久久久av不卡| 免费黄频网站在线观看国产| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品人妻久久久影院| 久久国产亚洲av麻豆专区| 内地一区二区视频在线| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品三级大全| 国产日韩欧美视频二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 看非洲黑人一级黄片| 日韩亚洲欧美综合| 国产伦在线观看视频一区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 水蜜桃什么品种好| 黄色配什么色好看| 777米奇影视久久| 人妻系列 视频| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 极品少妇高潮喷水抽搐| 婷婷色麻豆天堂久久| 午夜91福利影院| 久久亚洲国产成人精品v| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 一级毛片电影观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久综合国产亚洲精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 天美传媒精品一区二区| www.av在线官网国产| 国精品久久久久久国模美| 在线精品无人区一区二区三| 国精品久久久久久国模美| 久久久久国产网址| 热re99久久国产66热| 色94色欧美一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 国产av精品麻豆| 黄色毛片三级朝国网站 | freevideosex欧美| 久久鲁丝午夜福利片| 日日啪夜夜撸| 一本久久精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 只有这里有精品99| 日韩免费高清中文字幕av| 熟女av电影| xxx大片免费视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 男女边摸边吃奶| 能在线免费看毛片的网站| 麻豆成人av视频| 久久久国产一区二区| 国产深夜福利视频在线观看| av在线观看视频网站免费| 美女cb高潮喷水在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品三级大全| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看一区二区三区激情| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产av一区二区精品久久| 成人影院久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一级毛片我不卡| 天堂中文最新版在线下载| av女优亚洲男人天堂| 日韩av在线免费看完整版不卡| 韩国av在线不卡| 亚洲精品自拍成人| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品国产成人久久av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 免费人妻精品一区二区三区视频| 六月丁香七月| 黄色欧美视频在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 美女内射精品一级片tv| 男人添女人高潮全过程视频| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 中文欧美无线码| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲成人av在线免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人91sexporn| 丝袜在线中文字幕| 日韩人妻高清精品专区| 高清欧美精品videossex| 亚洲中文av在线| 成人漫画全彩无遮挡| 久热这里只有精品99| 99热网站在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产 精品1| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久久久国产电影| freevideosex欧美| 在线 av 中文字幕| 欧美区成人在线视频| 日本黄大片高清| 国精品久久久久久国模美| 黑丝袜美女国产一区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产黄片视频在线免费观看| 国产精品国产av在线观看| 亚洲av福利一区| 91成人精品电影| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲图色成人| 成人国产麻豆网| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 看十八女毛片水多多多| 日本av手机在线免费观看| 人妻 亚洲 视频| 成人国产av品久久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 中国国产av一级| 国产淫语在线视频| 国产精品人妻久久久影院| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产av新网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产成人免费观看mmmm| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产真实伦视频高清在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产在视频线精品| 国产av精品麻豆| 亚洲高清免费不卡视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中国国产av一级| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美国产精品一级二级三级 | 一级a做视频免费观看| 日韩视频在线欧美| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲av男天堂| 97在线人人人人妻| www.色视频.com| 国产日韩欧美亚洲二区| 99久久精品热视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 少妇人妻 视频| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 久久国产乱子免费精品| 国产一级毛片在线| 欧美日韩视频精品一区| 日本黄色片子视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 最近2019中文字幕mv第一页| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲av免费高清在线观看| 老司机影院毛片| 婷婷色综合www| 制服丝袜香蕉在线| 最近手机中文字幕大全| 色网站视频免费| 性色avwww在线观看| 色网站视频免费| 午夜福利影视在线免费观看| 高清午夜精品一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 精品熟女少妇av免费看| 热99国产精品久久久久久7| 日本黄大片高清| 下体分泌物呈黄色| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品第二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 另类精品久久| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品蜜桃在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99热这里只有精品一区| 亚洲怡红院男人天堂| av在线app专区| 女人精品久久久久毛片| 涩涩av久久男人的天堂| 日日撸夜夜添| 日本91视频免费播放| 久久久久视频综合| 免费人成在线观看视频色| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| 大片免费播放器 马上看| 国产有黄有色有爽视频| 一本大道久久a久久精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 简卡轻食公司| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品久久久久久久久av| 五月开心婷婷网| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一区二区三区四区激情视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 一边亲一边摸免费视频| kizo精华| 国产黄片视频在线免费观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级毛片我不卡| 日本免费在线观看一区| 国产精品熟女久久久久浪| 国产熟女午夜一区二区三区 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 26uuu在线亚洲综合色| 美女中出高潮动态图| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 自线自在国产av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 在线天堂最新版资源| 婷婷色av中文字幕| 亚洲内射少妇av| 久久女婷五月综合色啪小说| 人妻系列 视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久久久久久久成人| av女优亚洲男人天堂| 亚洲怡红院男人天堂| 中国美白少妇内射xxxbb| 国内精品宾馆在线| 最新中文字幕久久久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 日本色播在线视频| 久久这里有精品视频免费| 一区二区三区四区激情视频| 插逼视频在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 国产极品天堂在线| 欧美 日韩 精品 国产| 黑人高潮一二区| 国产精品不卡视频一区二区| 午夜免费鲁丝| 三级经典国产精品| 日韩免费高清中文字幕av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 少妇 在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久国产一区二区| 色5月婷婷丁香| videossex国产| 日韩人妻高清精品专区| 久热久热在线精品观看| 各种免费的搞黄视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久99热这里只频精品6学生| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久久久精品性色| 日本av免费视频播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚州av有码| 在线播放无遮挡| 99九九在线精品视频 |