中國人群CYP2D6基因多態(tài)性及其與激素受體陽性早期乳腺癌他莫昔芬代謝的關(guān)系

楊幃 李蘇 鄧穎斐 何彩云 廖海 魏文文 史艷俠

中山大學(xué)腫瘤防治中心腫瘤內(nèi)科（廣州510060）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，大約50%～60%的乳腺癌患者是激素受體（HR）陽性，內(nèi)分泌治療是這些患者治療計劃中不可缺少的部分［1-2］。他莫昔芬是絕經(jīng)前HR陽性患者的標(biāo)準(zhǔn)輔助內(nèi)分泌治療［3］。由于中國女性乳腺癌診斷的中位年齡為45～49歲，比白種人年輕10歲［4］，他莫昔芬的合理使用對中國乳腺癌患者具有更為現(xiàn)實的意義。但是，TAM的療效顯示出明顯的個體差異。到目前為止，我們還沒有一個好的標(biāo)記來預(yù)測TAM的療效。TAM作為一種前體藥抗腫瘤作用極弱，它進(jìn)入人體后需要經(jīng)過一系列霉作用轉(zhuǎn)化成其活性抗腫瘤成分endoxifen，在過去的10年中，有一些線索表明CYP2D6多態(tài)性，可能對霉活性（通過endoxifen/TAM比值間接評估酶活性）有很大影響，導(dǎo)致吲哚昔芬的濃度發(fā)生顯著變化，并可能與降低他莫昔芬的治療效果相關(guān)。一些回顧性研究描述了患者的CYP2D6基因型和TAM治療療效之間的關(guān)系，并探討了使用翻譯表或定量活動評分系統(tǒng)預(yù)測CYP2D6活性的可能性，以觀察具有不同CYP2D6活性患者TAM治療的療效和副作用。一些研究得出了不同的結(jié)論，CYP2D6基因型在預(yù)測TAM療效中的價值仍然存在爭議。

當(dāng)我們探索CYP2D6的真相時，發(fā)現(xiàn)CYP2D6多態(tài)性存在顯著的種族差異。CYP2D6基因多態(tài)性在中國人群中的分布與西方人群差異很大［5］。但我們沒有發(fā)現(xiàn)他莫昔芬在中國人群和高加索人群中的療效差異很大。到目前為止，還沒有前瞻性臨床試驗直接證據(jù)證明CYP2D6基因型-表型-吲哚昔芬的血藥濃度-TAM療效的關(guān)系，特別是在中國人群差異較大的基因型背景下，有必要進(jìn)行臨床研究探討它們內(nèi)部的關(guān)系及其對我們臨床實踐的影響。我們分析了臨床藥物遺傳學(xué)實施聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫（Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium CPIP）中的數(shù)據(jù)（https：//cpicpgx.org/）以觀察CYP2D6等位基因在東西方人群中的分布，并進(jìn)行前瞻性ⅡC期臨床試驗以確定中國人群CYP2D6基因型與吲哚昔芬的血藥濃度之間的相關(guān)性，探索一種改進(jìn)的基因型-表型預(yù)測系統(tǒng)分類方法來預(yù)測中國人群中吲哚昔芬的血藥濃度差異，并為后續(xù)分析TAM的療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 對2015年8月至2017年10月在中山大學(xué)腫瘤防治中心診治的133例患者行基因型測定；同時檢測其中88例患者血藥濃度。患者年齡28～58歲，中位年齡為45歲（表1）。接受他莫昔芬治療的激素受體陽性的絕經(jīng)前早期乳腺癌患者，包括新診斷的乳腺癌和目前使用TAM治療＜3年的患者。所有患者需要使用他莫昔芬治療至少40 d才能達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。TAM應(yīng)按固定時間10 mg/d，每12 h 1次口服。本研究不允許進(jìn)行劑量調(diào)整?；颊叻盟幬飫┝?，用藥時間受到嚴(yán)格控制，CYP2D6抑制劑的使用受到限制。納入標(biāo)準(zhǔn)：ECOG評分≤2，組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實為早期乳腺浸潤性癌（TNM分期Ⅰ～Ⅲ期），激素受體陽性（即在免疫組化方法檢測下至少有1%乳腺癌細(xì)胞為ER和或PR陽性），術(shù)后患者有內(nèi)分泌治療指征，擬接受TAM或已經(jīng)接受不足3年的TAM治療，預(yù)計生存期≥6個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：同時接受其他任何抗腫瘤治療，肝腎功能不全，急性炎癥期需治療，合并其他腫瘤，妊娠或哺乳期患者等。本研究得到中山大學(xué)腫瘤防治中心腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者在參加試驗前簽署知情同意書。

表1 患者的基本情況數(shù)據(jù)Tab.1 Demographic data for all eligible patients

1.2 CPIP數(shù)據(jù)資料收集 從CPIP數(shù)據(jù)庫下載CYP2D6基因型、二倍體型、及表型數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)庫是通過搜索PubMed?數(shù)據(jù)庫（1995年至2017年8月）匯總后數(shù)據(jù)。僅保留CPIP數(shù)據(jù)集中與本研究檢測相關(guān)的CYP2D6等位基因型病例。對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（表2）。

1.3 檢測方法

1.3.1 CYP2D6基因型檢測 從3 mL全血中提取白細(xì)胞DNA，并使用ABI 3500遺傳分析儀通過Sanger測序進(jìn)行分析。根據(jù)CYP2D6等位基因的解讀標(biāo)準(zhǔn)，我們選擇以前在中國人群中報道的最常見的7個等位基因，包括*1、*2、*4、*5、*10、*14和*41。根據(jù)基因型預(yù)測CYP2D6表型的標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ和Ⅱ［6-7］列于表3。

1.3.2 他莫昔芬和代謝物濃度檢測 當(dāng)患者服用他莫昔芬至少45 d時，開始收集血樣，3個月內(nèi)共抽取3次。服用他莫昔芬5.5 h后抽取3 mL靜脈血，隨后離心上清液。使用HPLC-MS/MS（API 2000）測定方法測量他莫昔芬和吲哚昔芬的血藥濃度，使用乙氧基苯甲酰胺作為內(nèi)標(biāo)。計算血清中待測藥物的濃度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線報告。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SSPS 20.0版本進(jìn)行分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用百分率描述分類變量，而使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述定量數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學(xué)差異比較采用卡方檢驗、方差分析（ANOVA）和t檢驗。

表2 在中國乳腺癌患者中的CYP2D6等位基因頻率及基因型分布Tab.2 CYP2D6 allele frequencies and Distribution of CYP2D6 genotypes in Chinese breast cancer patients

表3 不同代謝表型患者他莫昔芬和吲哚昔芬血藥濃度以及吲哚昔芬/他莫昔芬血藥濃度的比值差異比較Tab.3 Comparison of endoxifen:tamoxifen ratio and tamoxifen and endoxifen by AmpliChip CYP2D6 expected phenotype

2 結(jié)果

2.1 中國人群CYP2D6基因型-表型分布 本研究檢測的7種常見CYP2D6等位基因：CYP2D6*1、*2、*4、*5、*10、*14和*41分布頻率分別為28.9%、12.4%、0%、1.9%、48.1%、2.6%和6.0%。最常見的二倍體基因型為*1/*10（38.3%）、*10/*10（18.8%），其他二倍體基因型頻率均＜10%。根據(jù)CYP2D6的活性預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ［6］，中間表型IMs占85%，而正常代謝表型EM占15%。根據(jù)CYP2D6活性預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ［7-8］，中間表型（IMs）占 40.9%，正常代謝表型EMs占59.1%。本研究沒有發(fā)現(xiàn)差代謝表型患者（PMs）。見表3。

2.2 CPIP數(shù)據(jù)庫中的CYP2D6基因型-表型分布 根據(jù)臨床藥物遺傳學(xué)實施聯(lián)盟數(shù)據(jù)，高加索與東亞人群的CYP2D6等位基因頻率分布有顯著差異。CPIP數(shù)據(jù)中東亞人群的CYP2D6基因型分布與本研究中國人群基本一致，證明本研究基因測試結(jié)果是可靠的，并且強(qiáng)有力地保證了后續(xù)研究基因型分布與血漿濃度之間關(guān)系。

2.3 在各種二倍體、等位基因型中比較他莫昔芬和吲哚昔芬血藥濃度以及吲哚昔芬/他莫昔芬血藥濃度的比值差異 我們通過檢測他莫昔芬和吲哚昔芬血藥濃度以及吲哚昔芬/他莫昔芬血藥濃度的比值來評估CYP2D6酶的活性。CYP2D6雙倍型與年齡、BMI無關(guān)（P＞0.05）。各二倍體間以及中間表型（EM/IM，EM/PM，IM/IM和IM/PM）間的吲哚昔芬/他莫昔芬血藥濃度的比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01，P=0.007）。

由于本研究中檢測到的無功能性等位基因的數(shù)目較少，因此我們將它們（*4、*5和*14等位基因）組合到PM組中分析。對于*1、*2、*10、*41、PM等位基因型間吲哚昔芬血藥濃度以及吲哚昔芬/他莫昔芬血藥濃度的比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022，P=0.043），見圖1。

圖1 CYP2D6基因型與血藥濃度關(guān)系Fig.1 Relationship between selected CYP2D6 genotype groups and serum concentration

當(dāng)我們按照表型分類標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ［6］觀察正常代謝表型（EM）與中間表型（IM）之間的差異時，如表1所示，吲哚昔芬濃度以及吲哚昔芬/他莫昔芬血藥濃度的比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.841，P=0.268）。如果我們按照標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)颊哌M(jìn)行分組［7-8］，正常代謝表型（EM）與中間表型（IM）之間吲哚昔芬血藥濃度（P=0.001）和吲哚昔芬/他莫昔芬血藥濃度的比值（P=0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3，圖2）。

圖2 新表型分類體系與傳統(tǒng)分類體系比較Fig.2 Comparison between new phenotypic classification system and traditional classification system

2.4 通過聚類分析提出的新表型分類體系比原體系更好地反映CYP2D6活性 通過聚類分析我們將二倍體型重新歸類為3組：第1組包括所有除*1等位基因外，兩條等位基因均為純合突變類型；第2組包括所有雜合子，且其中一條等位基因是*1等位基因；第3組為純合子野生型，即攜帶兩條*1等位基因。3組間吲哚昔芬血藥濃度和吲哚昔芬/他莫昔芬濃度的比值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。組1與組2間吲哚昔芬血藥濃度差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）（圖2）。

3 討論

根據(jù)本研究和分析CIPI數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，中國南方乳腺癌患者CYP2D6基因型分布與前期結(jié)果一致［9］。目前已發(fā)現(xiàn)100多種不同的CYP2D6基因突變［10］。在高加索人群中CYP2D6*4發(fā)生率明顯高于中國人群，發(fā)生率分別為18.17%、0.65%。而中國女性中最常見的CYP2D6等位基因為CYP2D6*10，發(fā)生率為51.6%～57.4%，其僅占白種人的5%以下［11-12］。GAEDIGK等［13］根據(jù)CYP2D6探針右美沙芬代謝物譜，提出使用“主動評分”方法從基因型推斷CYP2D6表型。根據(jù)CYP2D6等位基因的不同變異和組合，通過翻譯表或定量活性評分將患者分成超快（UMs）、廣泛（EMs）、中間（IMs）或差（PMs）代謝的四種代謝表型［13-14］?？紤]到中國人群中*10等位基因的突變率及IMs表型的比例較高。使用基因型和活性表型分類系統(tǒng)Ⅰ［6］將正常代謝表型和中間表型進(jìn)行分組，實際檢測到的兩組吲哚昔芬血藥濃度差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。值得注意的是，*1和*2單體型間吲哚昔芬血漿濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且*2等位基因吲哚昔芬血漿濃度與IM等位基因相似，其他研究也有類似報道［15-16］。HERTZ等［15］發(fā)現(xiàn)*2等位基因活性與IM等位基因相似。右美沙芬藥代動力學(xué)研究顯示CYP2D6*2與野生型相比具有其約40%的活性［16］。在最近的報道中，*2等位基因可以改變外顯子剪接并減少基因表達(dá)［17］。在本研究中EM/IM、EM/PM、IM/IM和IM/PM四組間的吲哚昔芬血藥濃度和吲哚昔芬/TAM濃度比值的差異是非常大的，此前也有研究報道［15］。顯然目前的基因型-表型分類系統(tǒng)對中國人來說并不理想［6］。這種不適當(dāng)?shù)姆纸M可能是不同表型組間吲哚昔芬濃度沒有差異的原因之一。IMs表型組（IM/IM、EM/PM、IM/IM、IM/PM）在中國人群中占有很大的比例，且吲哚昔芬血藥濃度范圍很廣，有必要開發(fā)新的基因型-表型分類系統(tǒng)來滿足我們的臨床需求［8，18-20］。

既往有研究根據(jù)另一表型分類系統(tǒng)Ⅱ進(jìn)行分組［7-8］。本研究也探索了經(jīng)表型分類系統(tǒng)Ⅱ分組的患者間血藥濃度差異，發(fā)現(xiàn)在正常代謝和中間表型之間的吲哚昔芬血藥濃度和吲哚昔芬/TAM濃度比值存在統(tǒng)計學(xué)差異。而進(jìn)一步根據(jù)聚類分析，本研究探索的新的分類方法可能更適合于預(yù)測吲哚昔芬血藥濃度。但是，仍然有必要擴(kuò)大樣本量來驗證新的分類系統(tǒng)的預(yù)測價值。

本研究為第一個關(guān)于CYP2D6基因多態(tài)性的前瞻性研究，也是第一個將CYP2D6基因型與活性代謝產(chǎn)物吲哚昔芬濃度直接聯(lián)系起來的臨床研究。其中服用藥物劑量，用藥時間，體質(zhì)指數(shù)，肝腎功能，CYP2D6抑制劑的使用等受到嚴(yán)格控制。本研究存在一些局限性。首先，由于UM、PM表型患者的數(shù)量很小，我們無法評估這些表型之間的差異。其次，采用Sanger測序的方法進(jìn)行序列測定，根據(jù)文獻(xiàn)資料選取最常見的7個等位基因進(jìn)行分析。非目標(biāo)等位基因不能被檢測到并可能被錯誤分類。先前的研究報道，一些新發(fā)現(xiàn)的功能變異基因［21］2988G＞A應(yīng)該被定義為*41等位基因型，但是這些*41等位基因常常被錯誤地定義為*2等位基因，導(dǎo)致錯誤分類。最近的一項研究顯示，有24%預(yù)測為EM的基因型患者實際上表現(xiàn)為PM表型［22］。這種基因型和表型之間的差異被稱為表型轉(zhuǎn)化，引發(fā)關(guān)于基因分型是否可以準(zhǔn)確預(yù)測表型的討論［22-24］。另一項研究表明，CYP2D6基因型只能解釋39%的個體吲哚昔芬血藥濃度差異性?；诩韧捅狙芯拷Y(jié)果，CYP2D6基因型和代謝表型確存在不一致性，單一的CYP2D6基因型是否能準(zhǔn)確預(yù)測TAM的代謝狀態(tài)受到質(zhì)疑，需要進(jìn)一步研究開發(fā)新的CYP2D6表型預(yù)測系統(tǒng)指導(dǎo)中國人他莫昔芬治療。

已有研究人員［25］提出使用治療藥物監(jiān)測（TDM）作為準(zhǔn)確和全面的表型預(yù)測的方法，這使得基因分型的價值備受爭議。預(yù)測TAM表型的藥理試驗非常復(fù)雜，可能受到進(jìn)食食物和個體間生物利用度等多種因素的影響。近年來，已經(jīng)提出評估CYP2D6特異性底物及其代謝物的比值，可能比基因分型預(yù)測TAM代謝更為準(zhǔn)確。本研究結(jié)果顯示吲哚昔芬/TAM濃度比值是反映CYP2D6酶活性的較敏感和穩(wěn)定的指標(biāo)。新的分類系統(tǒng)中，吲哚昔芬/TAM濃度比值在不同組間差異有顯著性，提示新系統(tǒng)可能更適合我們的患者分組。

最后，本研究沒有考慮其他可能影響他莫昔芬血藥濃度的因素［11］，我們還沒有長期隨訪觀察他莫昔芬的療效，但是這項研究為進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

（志謝：王樹森，徐飛，袁中玉，王曦和唐軍同樣對這項研究作出了貢獻(xiàn)）

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