重組人促紅細(xì)胞生成素對成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響

周瀟齊 吳波 嚴(yán)鑫平 朱美松 彭延凱 陳仲

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院脊柱外科（廣州 510280）；2湖北省荊州市第一人民醫(yī)院骨科（湖北荊州434008）；3廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院骨科中心（福建漳州 363000）；南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病外科（廣州 510280）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱外科常見疾病之一，對患者的身體機(jī)能造成嚴(yán)重傷害，并帶來巨大的個人和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］，其傷后神經(jīng)功能修復(fù)問題仍是世界性難題。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是一種具有自我更新能力、多潛能分化和增殖能力的干細(xì)胞，大量研究表明神經(jīng)干細(xì)胞移植治療對于許多動物急性脊髓損傷模型有一定療效［2-3］。脊髓中央管膜下NSCs是位于脊髓內(nèi)的NSCs，主要存在于脊髓中央管的室周區(qū)域。相較于間充質(zhì)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞干細(xì)胞等其他來源NSCs，脊髓中央管膜下NSCs與脊髓神經(jīng)組織的組織特異性更接近，而且比胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等干細(xì)胞成瘤性更低［4］。因而，脊髓中央管膜下NSCs可能是細(xì)胞移植治療急性脊髓損傷的潛在理想細(xì)胞。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種主要由胎兒肝臟和成人腎臟分泌的糖蛋白細(xì)胞因子，其功能主要為調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成。近來，EPO的神經(jīng)保護(hù)作用得到廣泛關(guān)注，本課題組之前的研究［5］也發(fā)現(xiàn)延遲應(yīng)用人重組促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）治療急性脊髓損傷SD大鼠可有效改善損傷區(qū)域炎癥、減少受損細(xì)胞凋亡、促進(jìn)髓鞘再生，并促進(jìn)受傷大鼠功能恢復(fù)。WANG等［6］用EPO處理體外培養(yǎng)的新生鼠NSCs，發(fā)現(xiàn)可以通過減少細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等機(jī)制提高神經(jīng)干細(xì)胞的生存率并促進(jìn)細(xì)胞增殖。據(jù)筆者所知，目前關(guān)于EPO對成年脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞生存、增殖等影響的研究尚未有報道。本實驗擬通過比較不同濃度EPO培養(yǎng)成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs后各時間點(diǎn)的OD值，探討EPO影響成年大鼠脊髓中央管室膜下NSCs體外培養(yǎng)增殖能力的適宜濃度和處理時間長度，為臨床脊髓損傷的細(xì)胞治療提供實驗室理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量（270±10）g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。重組人促紅素注射液購于山東科興生物制品有限公司；木瓜蛋白分離酶試劑盒購于Worthington Biochemicals公司；DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基、Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27、左旋多聚賴氨酸、左旋谷氨酸、P/S雙抗均購自Gibco公司；戊巴比妥納、右旋葡萄糖、NaHCO3、HEPES、胰島素、去鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺、硒、孕酮、肝素、表皮生長因子（epidermalgrowth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、多聚賴氨酸、Hoechst33342均購自Sigma公司；小鼠抗巢蛋白（Nestin）抗體購于Cell Signaling Technology公司；山羊抗Sox2抗體均購自Santa Cruz公司；驢抗小鼠IgG/DyLight594、驢抗山羊IgG/DyLight488均購自EarthOx公司；CCK8試劑購于同仁化學(xué)研究所；TRIzol Reagent購于北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海星漢生物科技有限公司；熒光定量PCR檢測試劑盒購于美國Gene Copoeia公司；96孔板購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓源性NSCs的分離、消化、體外培養(yǎng)

1.2.1 .1 脊髓源性NSCs的分離 6～8周齡SD雄性大鼠，腹腔注射1 mL戊巴比妥鈉（65 mg/mL）處死，將頭部以下置于75%酒精中浸泡5 min消毒。消毒后在無菌條件下于下肢水平剪開相應(yīng)節(jié)段背部皮膚，剝離背部肌肉，用椎板摘除術(shù)依次暴露并取出腰、胸、頸脊髓組織，于外科顯微鏡下剝離組織表面的血管、脊膜及灰質(zhì)、白質(zhì)，留下小部分灰質(zhì)及脊髓中央管膜組織，顯微剪剪碎至1 mm3大小。

1.2.1 .2 脊髓源性NSCs的消化 將修剪后的組織塊放入3.5 mL木瓜酶分解酶混合液（含20 U/mL木瓜蛋白分解酶、0.005%脫氧核糖核酸酶Ⅰ、1 mmol/L半胱氨酸、0.5 mmol/L EDTA的EBSS溶液）中，于恒溫?fù)u床37℃下消化1 h。消化結(jié)束后，吸取上懸浮液于300g常溫下離心5 min。離心完成后，棄上清液，用2.7 mL卵類黏蛋白酶抑制劑溶液（含10 mg/mL卵類黏蛋白酶抑制劑、10 mg/mL清蛋白的EBSS溶液）和300 μL的脫氧核糖核酸酶Ⅰ溶液（含0.005%脫氧核糖核酸酶Ⅰ的EBSS）混合后重懸沉淀。緩慢地將懸液加在5 mL卵類黏蛋白酶抑制劑溶液表面上，于70g常溫下離心6 min后棄上清獲得沉淀細(xì)胞。

1.2.1 .3 脊髓源性NSCs體外培養(yǎng) 用EFH培養(yǎng)基（含86%Neurobasal-A培養(yǎng)基，10%hormone混合液，1%L-谷氨酰胺，1%P/S，2%B27，20 ng/mL表皮生長因子，20 ng/mL成纖維細(xì)胞生長因子，2 μg/mL肝素；hormone混合液由含0.6%葡萄糖，3 mmol/L NaHCO3，5 mmol/L HEPES，25 μg/mL 胰島素，100 μg/mL去鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，10 μmol/L腐胺，30 nmol/L硒，20 nmol/L孕酮的DMEM/F12組成）重懸沉淀細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)鏡下所觀察的細(xì)胞生長情況，每隔3～4 d離心、換液1次，6～8 d離心、吹打傳代1次。

1.2.2 脊髓源性NSCs的Nestin、Sox-2免疫熒光染色鑒定 將第3代脊髓中央管室膜下NSCs部分神經(jīng)球接種到多聚賴氨酸（濃度為0.1 mg/mL）處理的蓋玻片上，繼續(xù)培養(yǎng)15 min（神經(jīng)球），4%多聚甲醛固定15 min后，PBS洗3遍（5 min×3），0.2%Triton X-100室溫處理15 min，PBS洗3遍（5 min×3），1%BSA常溫封閉1 h，加入小鼠抗Nestin一抗（1∶300）和山羊抗Sox2一抗（1∶50），冰箱4℃過夜。次日用PBS洗3遍（5 min×3），加入DyLight594標(biāo)記-驢抗小鼠二抗（1∶100）和DyLight488標(biāo)記驢抗山羊二抗（1∶100），常溫避光孵育1.5 h，PBS洗3遍（5 min× 3），染核染料 Hoechst（1∶1 000）室溫5 min，PBS洗3遍（5 min×3），抗淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，照相。

1.2.3 CCK8細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的NSCs接種于每孔含有100 μL EFH培養(yǎng)基的96孔板中，每孔的細(xì)胞數(shù)量約為2 000個左右，且于細(xì)胞接種前向EFH中添加不同濃度EPO，使EPO的終濃度為10、20、40 U/mL，另設(shè)不加EPO（0 U/mL）的對照組，每組5個復(fù)孔，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑培養(yǎng)4 h。CCK8孵育完畢后于酶標(biāo)儀上測定450 nm吸光度，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞計數(shù)檢測 NSCs以1×103/mL的密度接種于每孔含2 mL體積EFH培養(yǎng)基的12孔板中，且于細(xì)胞接種前向EFH中添加不同濃度EPO，使EPO的終濃度為0 U/mL（對照組）、10 U/mL、20 U/mL、40 U/mL，每組3個復(fù)孔。于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，將12孔板中的神經(jīng)干細(xì)胞收集到15 mL離心管中，300g常溫下離心5 min。離心完畢后，用1 mL EFH培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，并輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液。用111 μL 0.4%臺盼藍(lán)溶液與懸液充分混合后，吸取20 μL混合懸液，加入到計數(shù)板中，利用自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。讀取結(jié)果，計算細(xì)胞濃度后，對比各濃度EPO組的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 Trizol試劑提取各濃度EPO處理4 d后的NSCs中總RNA，分光光度計測定其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，廣州四和生物科技有限公司根據(jù)Gene Bank序列合成引物序列，CyclinD1：（F）5′-AACTACCTGGACCGTTTCTTG-3′，（R）5′-GGGAATGGTCTCCTTCATCTTAG-3′，108 bp；GAPDH：（F）5′-CATCTCCCTCACAATTCCATCC-3′，（R）5′-GAGGGTGCAGCGAACTTTAT-3′，100 bp。反應(yīng)體系為：2× All-in-One qPCR Mix 10.0 μL，PCR forward primer（2 μmol/L）2.0 μL，PCR reverse primer（2 μmol/L）2.0 μL，cDNA 2.0 μL，50 × Rox Reference Dye，0.4 μL，ddH2O 3.6 μL。

反應(yīng)條件為初試變性95℃10 min 1次后，95℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 35 s共40個循環(huán)，以2-△△Ct表示mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件（IBM公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實驗結(jié)果計量資料以x±s表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），當(dāng)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察NSCs生長 原代脊髓中央管室膜下NSCs鏡下呈單細(xì)胞散在懸浮生長，培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2條件下靜止培養(yǎng)1周后細(xì)胞逐漸聚集生長形成體積大小不均一、不規(guī)則圓形類神經(jīng)球（圖1A）。原代NSCs傳代后培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1周，神經(jīng)干細(xì)胞聚集形成規(guī)則圓形、直徑約為100 μm的神經(jīng)球（圖1B）。傳至第3代后，神經(jīng)干細(xì)胞開始穩(wěn)定形成大量懸浮生長、大小均一的神經(jīng)球。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察NSCs生長情況Fig.1 The primary culture of NSCs derived from adult SD rats

2.2 免疫熒光染色鑒定結(jié)果 免疫熒光染色見NSCs可以穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nestin（圖2A）及干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2（圖2B），同時核染色可見Hoechst標(biāo)記（圖2C）。

2.3 EPO處理NSCs后行CCK8檢測450 nm處OD值 各濃度EPO處理組OD值在各時間點(diǎn)均高于對照組，但僅有20 U/mL處理組的OD值在72 h（P＜0.05）和96 h（P＜0.001）兩個時間點(diǎn)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且處理時間達(dá)96 h時有顯著差異（P＜0.001）。見圖3。

2.4 細(xì)胞計數(shù) 10、20、40處理組細(xì)胞數(shù)量均高于對照組（0 U/mL），且只有20 U/mL與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

2.5 熒光定量PCR 10 U/mL、20 U/mL兩組Cyclin D1 mRNA表達(dá)高于對照組（0 U/mL）。其中10 U/mL與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），20 U/mL與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。見圖5。

3 討論

脊髓損傷是一種十分嚴(yán)重的致殘性損傷，世界各國和地區(qū)的脊髓損傷發(fā)病率基本相同，年發(fā)病率大概為（30 ～ 40）/1 000 000［7］，且呈逐年上升趨勢。自REYNOLDS等［8］從鼠的神經(jīng)組織中提取出了具有分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，脊髓損傷的治療開始走上了神經(jīng)干細(xì)胞治療的道路。根據(jù)JAIN等［9］的一項對美國1993-2012年脊髓損傷流行病學(xué)的研究調(diào)查，脊髓損傷患者年齡構(gòu)成仍以老年人和成人為主，因而成年脊髓源性NSCs相較于胎源性或新生鼠源性脊髓NSCs用于移植治療脊髓損傷的臨床意義可能更大。在移植細(xì)胞時提高移植細(xì)胞數(shù)量越大時，取得的療效也會相對更好［10］，其原因可能為受損區(qū)域中存活下來的移植神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量也會相對變多［11］。因此，如何促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，對于提高細(xì)胞移植治療脊髓損傷的療效是十分有必要的。過去，人們一直認(rèn)為EPO只是一種作用于造血細(xì)胞的內(nèi)分泌激素，但隨著人們對EPO研究的深入，EPO已被證實是一種新型的具有神經(jīng)保護(hù)作用［5，12-13］的組織因子。其體外應(yīng)用可以促進(jìn)新生鼠脊髓來源NSCs或成年大鼠海馬來源 NSCs的增殖［6，14］，而關(guān)于 EPO 促進(jìn)成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs增殖的研究還較少。

圖2 NSCs的Nestin、Sox2染色鑒定Fig.2 Immunofluorescence stain of adult rat spinal cord

圖3 CCK8檢測細(xì)胞活力Fig.3 OD values of neural stem cells affected by EPO of different concentation were evaluated by CCK8 at different time points

圖4 細(xì)胞計數(shù)檢測NSCs增殖情況Fig.4 Cell counts at 96 h after treatment of different concentrations of EPO in NSCs

圖5 qPCR檢測Cyclin D1 mRNA表達(dá)Fig.5 The relative expression levels of Cyclin D1 mRNA of NSCs at 96 h after treatment with different concentrations of EPO were determined by qPCR

本研究通過可靠的提取方法從成年SD大鼠脊髓中央管膜下提取出神經(jīng)干細(xì)胞，并通過Nestin和Sox2免疫熒光染色鑒定提取、培養(yǎng)的細(xì)胞正是神經(jīng)干細(xì)胞。Nestin是神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白［15］，表明從脊髓中央管膜下所提取的細(xì)胞正是NSCs；Sox2是神經(jīng)干細(xì)胞保持自我更新能力和維持多能干性的一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子［16］，表明從脊髓中央管膜下所提取NSCs不但有自我更新能力，還具備一般NSCs所擁有的多能干性。此后，我們通過CCK8檢測發(fā)現(xiàn)20 U/mL EPO處理組在72 h（P＜0.05）和96 h（P＜0.001）兩個時間點(diǎn)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且時間長達(dá)96 h時有統(tǒng)計學(xué)差異。該結(jié)果說明20 U/mL濃度EPO可有效促進(jìn)NSCs的增殖，且在96 h最為顯著。同時，96 h的細(xì)胞計數(shù)表明20 U/mL組的脊髓中央管膜下NSCs細(xì)胞數(shù)量較對照組有所增加（P＜0.01），也從細(xì)胞數(shù)量上直觀地反映出20 U/mL濃度EPO對NSCs的增殖效應(yīng)。Cyclin D1是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白［17］，主要作用為促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。熒光定量PCR結(jié)果示20 U/mL組脊髓中央管膜下NSCs的Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)水平較對照組有明顯提高，結(jié)合CCK8檢測、細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，表明20 U/mL濃度EPO可能通過上調(diào)Cyclin D1 mRNA表達(dá)，增加細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1生成，從而促進(jìn)更多NSCs細(xì)胞周期進(jìn)入S期以發(fā)揮促細(xì)胞增殖效應(yīng)。WANG等［6］通過細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)EPO可能通過促進(jìn)新生鼠NSCs進(jìn)入S期、增加DNA合成以促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，該機(jī)制分析與筆者的推測一致。

綜上所述，本實驗首先成功從成年大鼠脊髓中央管膜下分離出NSCs，進(jìn)而探討了不同濃度EPO對于成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)20 U/mL的濃度和96 h的處理時間可能是發(fā)揮EPO的促增殖作用的適宜濃度和處理時間。最后，也初步探討了EPO促進(jìn)成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs增殖的細(xì)胞周期影響機(jī)制。但EPO體外培養(yǎng)促進(jìn)成年NSCs增殖和生存的具體分子機(jī)制及上下游信號通路仍有待深入探討，這也是本課題組未來將致力研究的方向。

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