Neuritin與HSP60在急性肝損傷修復(fù)中的表達(dá)變化及意義

王朝陽 朱美意 歐陽軍 張宏偉

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科（新疆石河子 832000）

肝臟是機(jī)體執(zhí)行解毒和代謝自穩(wěn)態(tài)功能的主要器官［1］，參與多種物質(zhì)代謝及凝血因子的合成［2-3］，而肝損傷是威脅我國人民健康的重大疾病之一［4］。雖然肝臟具有強(qiáng)大的儲(chǔ)備功能及再生能力［5］，但其再生修復(fù)的分子機(jī)制目前尚未完全清楚，如何促進(jìn)肝損傷后的再生修復(fù)已成為臨床亟待解決的問題，成為近年來的研究熱點(diǎn)。

WIBRAND等［6］對肝臟研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期小鼠Neuritin基因的表達(dá)水平隨著肝臟的發(fā)育而逐漸增高，至成年期時(shí)達(dá)到頂峰，隨后將成年小鼠肝臟70%切除，發(fā)現(xiàn)Neuritin基因的表達(dá)水平出現(xiàn)一過性降低，隨著肝臟再生的開始其表達(dá)水平開始回升并且回升的時(shí)間與cyclinD1一致，而cyclinD1是肝臟發(fā)育成熟和再生的一個(gè)重要指標(biāo)。由此推測Neuritin可能具有促進(jìn)肝臟再生的作用，而Neuritin作為神經(jīng)營養(yǎng)因子在人體內(nèi)多個(gè)器官表達(dá)，其研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)，在肝損傷及修復(fù)過程中的變化及作用國內(nèi)外幾乎處于空白。本課題組于1999年在國內(nèi)首先克隆了Neuritin基因［7］，并通過酵母雙雜交技術(shù)在酵母菌體內(nèi)構(gòu)建了Neuritin真核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了分泌型Neuritin蛋白，進(jìn)一步［8］以Neuritin為誘餌發(fā)現(xiàn)了Neuritin與細(xì)胞增殖和分化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)均有相互作用，其中包括熱休克蛋白60（heat shock proteins 60，HSP60）。HSP60屬于熱休克蛋白家族中的一種，是機(jī)體在各種理化因子刺激下產(chǎn)生的一類高度保守的蛋白質(zhì)［9-11］，其最主要的功能是作為分子伴侶［12］，參與新生肽鏈的折疊與裝配、對變性蛋白的修復(fù)或加速其降解、促進(jìn)損傷細(xì)胞的自我修復(fù)，以保護(hù)機(jī)體在各種有害因素刺激時(shí)不受或少受傷害［13］，但目前國內(nèi)對HSP60的研究卻相對較少，而在肝損傷修復(fù)中的研究國內(nèi)外卻少有涉及。

因此，基于上述研究，筆者推測Neuritin與HSP60在肝損傷修復(fù)方面可能功能相關(guān)、共同參與并促進(jìn)了肝損傷的再生修復(fù)，但是缺乏必要的客觀線索或依據(jù)，迄今尚未見任何研究將它們有意識地進(jìn)行比較和聯(lián)系，更未見兩者在肝損傷修復(fù)中的研究與報(bào)道，故筆者將研究集中于兩者在肝損傷修復(fù)上，在繼酵母雙雜交之后，本研究利用免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測Neuritin與HSP60在肝損傷修復(fù)過程中的表達(dá)變化差異，探討兩者在肝損傷修復(fù)過程中的意義及可能機(jī)制，為深入研究肝損傷修復(fù)的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)、提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 Sprague-Dawley（SD）大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心；Neuritin、HSP60抗體（Abcom公司）；蛋白分子量marker（Fermantes公司），β-actin抗體（SIGMA公司）；PVDF膜（Solarbio公司）；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及標(biāo)本采集 由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供同一批次（批號XJZZQ（XK）200301）5周齡、清潔級、雌雄不限的SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心分籠飼養(yǎng)，保持12 h光照、12 h避光循環(huán)，恒溫恒濕、標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)抽樣原則將其分為空白組（n=6）和實(shí)驗(yàn)組（n=42），空白組為0 h觀察點(diǎn)，其中實(shí)驗(yàn)組均行肝左葉70%切除以誘導(dǎo)急性肝損傷［14］，分別于術(shù)后6、12、24、48 h及3、7、14 d再次手術(shù)切除殘余肝左葉，部分肝臟標(biāo)本用于Western Blot檢測，一部分于10%福爾馬林固定，常規(guī)包埋、切片行HE染色。相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)從尾緣靜脈采血約1 mL、室溫靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取血清送往石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，由專業(yè)檢驗(yàn)人員利用全自動(dòng)生化分析儀檢測ALT、AST濃度。所有大鼠均通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2.2 肝組織HE染色 取肝組織石蠟塊，制備切片（4 μm），蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.2.3 Western Blot取各時(shí)間點(diǎn)肝組織標(biāo)本約50 mg，提取蛋白后混勻，于10%和15%的SDS-PAGE中電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜中，5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗（Neuritin抗體1∶500、HSP60抗體1∶20 000、β-action抗體1∶1 000），室溫孵育4～6 h，TBST洗膜4次，每次15 min；加入HPR標(biāo)記的二抗，孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后用ECL發(fā)光試劑盒顯影檢測蛋白印跡條帶，以目的蛋白和內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組大鼠均進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析，中途無遺失，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示；不同時(shí)間點(diǎn)之間的比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，采用Pearson方法分析Neuritin、HSP60分別與ALT、AST相關(guān)性，所有檢驗(yàn)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性肝損傷修復(fù)模型的鑒定

2.1.1 術(shù)后行為學(xué)觀察及存活率統(tǒng)計(jì) 與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠毛發(fā)略凌亂、光澤度降低，精神萎靡、嗜睡，活動(dòng)量減少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，初次及二次術(shù)后所有大鼠均存活，切口愈合良好，無感染滲血等并發(fā)癥的發(fā)生，二次術(shù)后精神、活動(dòng)及食欲恢復(fù)良好，14 d存活率為100%。

圖1 肝左葉70%切除術(shù)誘導(dǎo)急性肝損傷Fig.1 Development of an acute liver-injury model by resection of the 70%left hepatic lobe

2.1.2 血液生化檢查 空白組及肝損傷組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ALT和AST水平變化，見表1。在各個(gè)時(shí)間段，6 h時(shí)，肝損傷組ALT、AST水平較空白組有顯著升高（P＜0.05），并且在12、24 h時(shí)持續(xù)升高（P＜0.05），48 h繼續(xù)升高并達(dá)到高峰（P＜0.05），提示造模成功；3 d時(shí)開始下降、7 d時(shí)繼續(xù)下降，但仍顯著高于空白組（P＜0.05）；14 d幾乎恢復(fù)正常，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

在各時(shí)間點(diǎn)，ALT、AST組間兩兩比較，14 d時(shí)ALT、AST與0 h比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.1.3 病理分析 圖2顯示：空白組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)較為規(guī)則，胞漿均勻紅染，細(xì)胞核大小正常，核質(zhì)淡染，肝細(xì)胞無變性、壞死等；肝細(xì)胞索排列整齊并以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰呈多邊形，大小基本一致，小葉間分界清楚，整個(gè)肝無明顯充血、變形、壞死病理改變。實(shí)驗(yàn)組可見正常肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)灶狀壞死，肝小葉界限模糊、扭曲變形，中央靜脈偏離或消失，肝細(xì)胞索排列紊亂，失去正常放射狀排列，肝細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞核偏心分布，部分細(xì)胞胞核消失，間質(zhì)充血伴有炎癥細(xì)胞浸潤，肝竇擴(kuò)張其內(nèi)紅細(xì)胞淤積，肝竇腔隙消失，肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，甚至出現(xiàn)大片狀壞死。

表1 各組大鼠血清ALT/AST表達(dá)Tab.1 Serum ALT and AST levels in rats x±s

2.2 Neuritin與HSP60在肝損傷修復(fù)過程中的表達(dá)變化差異 與空白組對比，Neuritin在肝損傷后6、12、24、48 h的表達(dá)量逐漸降低，并在48 h時(shí)達(dá)到最低，在損傷后3、7、14 d其表達(dá)量逐漸升高（F=172.195，P＜ 0.05）；HSP60在肝損傷后6、12、24、48 h的表達(dá)量逐漸升高，并在48 h時(shí)表達(dá)最高，在損傷后3、7、14 d其表達(dá)量逐漸下降（F=130.731，P＜ 0.05）。見圖3。

圖2 各組大鼠臟組織H E染色Fig.2 Histological changes were analyzed by HE

圖3 Neuritin與HSP60在肝損傷修復(fù)過程中的表達(dá)變化差異Fig.3 Analysis of Neuritin and HSP60 proteins expression in acute liver injury

2.3 Neuritin、HSP60與肝損傷的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，在肝損傷后 6、12、24、48 h、3、7、14 d，HSP60的表達(dá)變化趨勢與血清ALT、AST的變化趨勢之間存在顯著正相關(guān)性（r=0.898 1，P＜0.001）、（r=0.925 2，P＜0.001），說明HSP60的表達(dá)變化與肝損傷修復(fù)的進(jìn)程密切相關(guān)；Neuritin的表達(dá)變化趨勢與血清ALT、AST的變化趨勢之間存在顯著的負(fù)相關(guān)性（r=-0.813 1，P＜ 0.001）、（r=-0.832 3，P＜0.001），說明Neuritin的表達(dá)變化也與肝損傷修復(fù)的進(jìn)程密切相關(guān)。見圖4。

圖4 Neuritin、HSP60與ALT、AST相關(guān)性分析（Pearson相關(guān)）Fig.4 Neuritin and HSP60 expression levels in relation to acute liver injury

2.4 Neuritin與HSP60在肝損傷修復(fù)過程中的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，在肝損傷后6、12、24、48 h、3、7、14 d，Neuritin的表達(dá)變化趨勢與HSP60的表達(dá)變化趨勢之間存在顯著的負(fù)相關(guān)性（r=-0.060 5，P＜0.001），說明Neuritin與HSP60在肝損傷修復(fù)過程中的表達(dá)變化趨勢密切相關(guān)。見圖5。

圖5 Neuritin與HSP60的相關(guān)性分析（Pearson相關(guān)）Fig.5 Neuritin expression levels in relation to HSP60

3 討論

急性肝損傷是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一［15-16］，多種原因可引起肝功能異常和肝損傷［17］，如藥物性損傷、免疫性損傷、外傷暴力損傷等等，其具體機(jī)制異常復(fù)雜，目前尚未完全清楚，更不清楚損傷后再生修復(fù)的確切分子機(jī)制［18-20］。因此，建立穩(wěn)定、有效的急性肝損傷修復(fù)動(dòng)物模型是研究其損傷機(jī)制、再生以及防治的關(guān)鍵性技術(shù)［21］。本實(shí)驗(yàn)采用單純性肝葉部分切除術(shù)建立急性肝損傷修復(fù)模型，該方法不需要解剖及阻斷肝門，操作簡單、成功率高，與傳統(tǒng)的Pringle法［22］相比有效地避免了肝臟缺血再灌注的損傷和術(shù)后殘肝細(xì)胞再生不良。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加，ALT和AST即從細(xì)胞內(nèi)逸出，使血液ALT、AST水平升高［23］，在一定程度上反映了肝細(xì)胞的損傷程度［3］，而血液ALT、AST升高被認(rèn)為是判斷急性肝損傷嚴(yán)重程度的經(jīng)典指標(biāo)［24］，其隨時(shí)間變化的趨勢反映出損傷后再生修復(fù)的啟動(dòng)及進(jìn)展［25］。與空白組比較，實(shí)驗(yàn)組ALT、AST含量顯著升高并于術(shù)后48 h達(dá)到高峰，進(jìn)一步肝組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，空白組肝組織正常，而肝損傷組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞及肝細(xì)胞腫脹、壞死，在術(shù)后48 h最為明顯，提示肝損傷逐漸加重并于術(shù)后48 h最重，血液生化及病理改變確定了該損傷模型的成立。

當(dāng)機(jī)體受到有害因素刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)HSPs合成增加，它能保護(hù)機(jī)體（或細(xì)胞）不受或少受有害因素的傷害［13］。實(shí)驗(yàn)組在肝損傷后 6、12、24、48 h，其血清ALT、AST不斷升高，病理組織顯示肝臟損傷程度不斷增加，表明肝損傷在逐漸加重，此時(shí)HSP60的表達(dá)量也逐漸上升，并且在第48小時(shí)時(shí)肝損傷程度與HSP60表達(dá)量同步達(dá)到高峰，可能是其對肝臟應(yīng)激保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)的表現(xiàn)。在肝損傷后3、7、14 d，其血清ALT、AST和病理組織顯示肝臟的損傷程度逐漸降低，表明肝損傷在逐漸修復(fù)，此時(shí)HSP60的表達(dá)量也逐漸下降，說明可能隨著肝損傷逐漸得到修復(fù)HSP60的應(yīng)激保護(hù)作用逐漸下降。在整個(gè)肝損傷修復(fù)過程中，隨著損傷的加重或修復(fù)，HSP60的表達(dá)量也隨之同步變化呈正相關(guān)，說明HSP60可能參與了肝臟的損傷修復(fù)，可能體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面［26］：抵抗損傷和加速修復(fù)。在創(chuàng)傷等應(yīng)激原的作用下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生變性或異常的蛋白質(zhì)，表現(xiàn)為肽鏈伸展、失去盤旋及折疊狀態(tài)，分子空間構(gòu)型的改變等，但此時(shí)HSP60發(fā)揮了分子伴侶作用，使蛋白質(zhì)肽鏈重新折疊并恢復(fù)原來的構(gòu)象及功能，從而在應(yīng)激等不利狀態(tài)下提高細(xì)胞的抵抗力起到抗損傷作用；如果蛋白變性不可逆，HSP則幫助變性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入溶酶體加以清除，從而加速了組織的修復(fù)，因此表現(xiàn)為隨著肝損傷的加重或修復(fù)、HSP60的表達(dá)量隨之升高或降低?？傊?，HSP60是保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能免受損傷所必需的，如何加強(qiáng)和利用HSP60的抗損傷和促進(jìn)修復(fù)作用，則是今后的研究方向之一。

Neuritin（又稱 candidate plasticity-related gene 15，CPG15）［27］最初被認(rèn)為是一條高度限制在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的基因，它能促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長，后來的研究證實(shí)［28］Neuritin在肝組織中也有明顯表達(dá)，并且還介導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)以外其他細(xì)胞的再生。實(shí)驗(yàn)組在肝損傷后6、12、24、48 h，其血清ALT、AST不斷升高，病理組織顯示肝臟損傷程度不斷增加，表明肝損傷在逐漸加重，此時(shí)Neuritin的表達(dá)量逐漸下降，并且在第48小時(shí)肝損傷程度最重時(shí)，其表達(dá)量卻最低，可能是其對肝再生的作用逐漸減弱的表現(xiàn)。在肝損傷后3、7、14 d，其血清ALT、AST和病理組織顯示肝臟的損傷程度逐漸降低，表明肝損傷在逐漸修復(fù)，此時(shí)Neuritin的表達(dá)量卻逐漸上升，說明可能隨著肝損傷逐漸得到修復(fù)Neuritin對肝再生的作用逐漸增強(qiáng)。在整個(gè)肝損傷修復(fù)過程中，隨著肝損傷的加重或修復(fù)，Neuritin的表達(dá)量也呈現(xiàn)出一定變化規(guī)律呈負(fù)相關(guān)，說明Neuritin也可能參與了肝臟的損傷修復(fù)，但是具體分子機(jī)制目前國內(nèi)外未見任何報(bào)道。我們推測：Neuritin作為神經(jīng)營養(yǎng)因子，在肝臟組織中如同神經(jīng)系統(tǒng)一樣，可能通過以下途徑促進(jìn)肝損傷的再生修復(fù)：（1）Neuritin促進(jìn)肝臟中神經(jīng)再生：CPG15基因是神經(jīng)活動(dòng)和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子作用的下游基因［6，29-30］，提示Neuritin是神經(jīng)活動(dòng)和各種神經(jīng)生長因子的下游因子，Neuritin可以促進(jìn)神經(jīng)突起的生長及其分支和突觸的發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形成［31］，而無論是神經(jīng)活動(dòng)的刺激還是神經(jīng)生長因子的直接作用都能誘導(dǎo)神經(jīng)突起的生長，而神經(jīng)纖維的長入可影響肝損傷的再生修復(fù)；（2）Neuritin促進(jìn)肝臟中血管再生：KOJIMA等［28］通過給予人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞重組的Neuritin，發(fā)現(xiàn)Neuritin能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及促進(jìn)腫瘤組織中血管的生長，因而認(rèn)為Neuritin可以被看做是一種血管生長因子，可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移能力，有利于新生毛細(xì)血管的生長，改善肝損傷后的血流動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)肝損傷后的再生修復(fù)；（3）Neuritin與其他因子協(xié)同作用，具體有待于進(jìn)一步研究。

STORTI等［32］研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激作用下，熱休克反應(yīng)（heat shock response，HSR）可抑制正常蛋白的合成，卻能使HSP大量表達(dá)并通過修復(fù)變性的蛋白而發(fā)揮對蛋白分子的應(yīng)激保護(hù)作用。圖4表明，肝損傷后48 h內(nèi)，隨著損傷的逐漸加重HSP60的表達(dá)量逐漸增加，而Neuritin的表達(dá)量卻逐漸下降，可能是HSR一方面抑制了Neuritin等重要蛋白的合成以減少應(yīng)激對其所致的蛋白分子損傷；另一方面促進(jìn)了HSP60的表達(dá)量增加，以促進(jìn)HSP60對損傷的Neuritin等重要蛋白的修復(fù)。肝損傷48 h以后，隨著損傷因素的逐漸減弱，HSR也隨之逐漸降低，一方面HSR對Neuritin等重要蛋白的合成抑制作用逐漸減弱，從而使Neuritin的表達(dá)量逐漸升高，表現(xiàn)出Neuritin對肝臟的再生作用逐漸增強(qiáng)；另一方面，HSR促進(jìn)HSP60合成的作用也逐漸減弱，從而使其表達(dá)量逐漸下降。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示，在肝損傷修復(fù)的整個(gè)過程中，Neuritin與HSP60的表達(dá)變化趨勢截然相反，呈顯著的負(fù)相關(guān)性，該結(jié)果與STORTI等的結(jié)論相吻合，說明了兩者可能共同參與了肝損傷的再生修復(fù)。

因此，HSP60不僅降低了損傷因素帶來的傷害，即抵抗肝損傷；而且還促進(jìn)了肝臟的再生修復(fù)，而Neuritin可能僅僅促進(jìn)了肝損傷后的再生修復(fù)?；谏鲜鲅芯考敖湍鸽p雜交實(shí)驗(yàn)［8］結(jié)果，我們大膽猜測：HSP60與Neuritin在肝損傷修復(fù)過程中可能功能相關(guān)，HSP60很可能作為Neuritin的上游因子通過某條信號通路發(fā)生相互作用而產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)，共同促進(jìn)了肝損傷的再生修復(fù)，但具體信號通路及生物學(xué)機(jī)制有待于我們進(jìn)一步深入研究，這也是本研究存在的局限性及不足之處，本課題組后續(xù)將進(jìn)一步研究HSP60與Neuritin的關(guān)系及可能作用的信號通路，為研究肝損傷修復(fù)的發(fā)生發(fā)展提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為肝損傷的治療提供新的思路。

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