重組分泌型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體腺病毒對(duì)PC-3細(xì)胞荷瘤鼠瘤體的生長(zhǎng)抑制

高磊 潘鐵軍 謝鳴 蔣淵 喻希 李想

中國(guó)人民解放軍武漢總醫(yī)院泌尿外科（武漢 430070）

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）被發(fā)現(xiàn)后，經(jīng)過(guò)不斷研究證實(shí)其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。TRAIL能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，被認(rèn)為是一種很有前途的抗癌分子。我們前期成功構(gòu)建了表達(dá)分泌型TRAIL基因的腺病毒載體Ad-sTRAIL，并且在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了Ad-sTRAIL可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究試圖探討Ad-sTRAIL的體內(nèi)抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

1.1.1 人前列腺癌細(xì)胞株 PC-3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Ad-LacZ病毒，Ad-sTRAIL病毒均由本科構(gòu)建保存。鼠抗人TRAIL單克隆抗體及兔抗鼠熒光素標(biāo)記二抗均購(gòu)自Santa公司。新生牛血清購(gòu)于北京四季青生物技術(shù)公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco BRL公司）。DAPI染色液購(gòu)于Beyotime公司。TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Roche公司。本研究起止時(shí)間為2015年3月至2016年10月。

1.1.2 分組 Control組：常規(guī)培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞；Ad-LacZ組：40 MOI的Ad-LacZ感染的PC-3細(xì)胞；Ad-sTRAIL組：40 MOI的Ad-sTRAIL感染的PC-3細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 高壓消毒后無(wú)菌蓋玻片置于24孔板中，取細(xì)胞濃度5×105/mL，每孔300 μL，接種后每24小時(shí)分別以40 MOI的Ad-LacZ和Ad-sTRAIL感染相應(yīng)分組細(xì)胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h。以4%多聚甲醛固定爬片，經(jīng)0.1%Triton PBS作用5 min，0.01 mol/L PBS溶液洗滌，滴加DAPI染液染色10 min，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 Transwell實(shí)驗(yàn) 采用孔徑為8 μm的24孔Borden小室（美國(guó)BD公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗小室上室2次，然后加入1∶8稀釋的Matrigel膠（美國(guó)BD公司）50 μL，37℃孵育30 min制作人工基底膜。以無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2 × 105個(gè)/mL，上室加入細(xì)胞懸液200 μL，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)72 h后以Giemsa染色觀察穿入下室面的細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn) PC-3細(xì)胞接種于雄性BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。待瘤塊長(zhǎng)至足夠大時(shí)，取新鮮腫瘤組織在生理鹽水中剪成3 mm×3 mm×3 mm大小的小塊接種裸鼠右側(cè)背部，選取荷瘤成功的裸鼠18只；隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為對(duì)照組、Ad-LacZ組和Ad-sTRAIL組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后7、14 d給藥，共給藥2次。每3天測(cè)量1次瘤體的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按腫瘤體積V=a×b2/2。共觀察21 d，依據(jù)腫瘤體積計(jì)算腫瘤抑瘤率（%）=1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/對(duì)照組腫瘤體積。

1.2.4 荷瘤組織免疫組化 4%多聚甲醛固定，制作蠟塊、切片、貼片；用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min。PBS清洗；加入0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液30 min，PBS清洗5 min×3；0.3%Triton×100處理30 min，PBS清洗5 min×3。加入1∶500稀釋的鼠抗人TRAIL單克隆抗體，4℃存放24 h；吸去抗體，PBS清洗5 min×3。加入PBS稀釋的以生物素標(biāo)記的兔抗鼠二抗，室溫孵育2 h。PBS清洗5 min×3。加入ABC復(fù)合物，室溫孵育2 h，PBS清洗5 min×3；蒸餾水迅速?zèng)_3次。加入DAB顯色10 min，用蒸餾水迅速?zèng)_洗，蘇木素復(fù)染30 s；梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

1.2.5 荷瘤組織TUNEL染色 4%多聚甲醛固定，制作蠟塊、切片、貼片；用二甲苯及梯度乙醇；PBS漂洗3次；用Proteinase K工作液處理組織15 min在37℃；PBS漂洗3次；加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片反應(yīng)37℃×1 h。PBS漂洗3次；加50 μL converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片反應(yīng)37℃×30 min。PBS漂洗3次；在組織處加100 μL DAB底物，反應(yīng)25℃×10 min；PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素復(fù)染30 s。梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果中定量數(shù)據(jù)用±s表示，均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAPI染色 Ad-sTRAIL組腫瘤細(xì)胞凋亡水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組。Ad-sTRAIL組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，胞漿致密，核染色質(zhì)邊集，并且胞核裂解，形成含核碎片和細(xì)胞器成份的凋亡小體（圖1）。

2.2 TranswellAd-sTRAIL組穿入下室面的細(xì)胞數(shù)（24.8±3.70）明顯少于對(duì)照組（47.6±4.28，q=10.68，P＜0.01）及Ad-LacZ組（49.6±4.39，q=11.61，P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 與Control組和Ad-LacZ組的細(xì)胞相比，Ad-sTRAIL組的荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)能力顯著降低（圖3）。經(jīng)計(jì)算后可見(jiàn)Ad-sTRAIL對(duì)荷瘤鼠腫瘤的抑制率3 d為8.15%（P＜0.05），6 d為11.55%（P＜0.01），9 d為17.23%（P＜0.01），12 d為20.05%（P＜0.01），15 d為27.18%（P＜0.01），18 d為34.27%（P＜0.01），21 d為33.08%（P＜0.01），隨時(shí)間抑制作用逐漸增強(qiáng)。

圖1 Ad-sTRAIL對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響（×200）Fig.1 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells apoptosis（× 200）

圖2 Ad-sTRAIL對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）Fig.2 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells invasion（× 200）

圖3 Ad-sTRAIL對(duì)荷瘤鼠腫瘤增殖能力的影響Fig.3 The effects of Ad-sTRAIL on the tumor proliferation of tumor-bearing mice

2.4 免疫組化實(shí)驗(yàn) Ad-sTRAIL組荷瘤鼠腫瘤組織中TRAIL表達(dá)水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組（圖4）。TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示：Ad-sTRAIL組荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞核染色明顯，表明該組細(xì)胞凋亡水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組（圖5）。

3 討論

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤。在北美和歐洲國(guó)家中，前列腺癌為男性的第二大惡性腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率也有明顯增加的趨勢(shì)［1］。目前，對(duì)于伴發(fā)轉(zhuǎn)移的難治性前列腺癌主要的治療方法是化療。但由于前列腺癌屬于對(duì)化療不敏感的腫瘤，并常產(chǎn)生耐藥性，所以常規(guī)化療很難達(dá)到令人滿意的治療效果。隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的不斷研究，基因治療已成為前列腺癌治療的重要方法［2］。

TRAIL是腫瘤壞死因子家族的新成員，其可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡等，但對(duì)正常的細(xì)胞卻無(wú)影響［3］。有研究表明：TRAIL可以抑制人肺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；并且當(dāng)TRAIL與格列吡嗪聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可以發(fā)揮更好的抗腫瘤效果［4］。同時(shí)，TRAIL在小細(xì)胞肺癌和肝癌中發(fā)揮重要作用，其主要是通過(guò)活化Caspase-8達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。但TRAIL的促凋亡作用可被DNA損傷誘導(dǎo)凋亡抑制因子（DNA damage-induced apoptosis suppressor，DDIAS）減弱［5］。此外，TRAIL可與結(jié)腸癌細(xì)胞中的死亡受體結(jié)合，活化Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas associated death domain protein，F(xiàn)ADD），從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。并且，TRAIL與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）聯(lián)合應(yīng)用可以進(jìn)一步增強(qiáng)其促凋亡作用［6］。大量研究表明TRAIL可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［7］。作為腫瘤壞死因子家族TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體，TRAIL可與死亡受體（TRAIL-R1和TRAIL-R2）結(jié)合，激活Caspase信號(hào)通路，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。TRAIL-R2在前列腺癌中高表達(dá)，特別是晚期前列腺癌［8］。因此前列腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL反應(yīng)敏感，所以構(gòu)建表達(dá)TRAIL的腺病毒用于治療前列腺癌存在理論基礎(chǔ)［9］。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)分泌型TRAIL基因的腺病毒載體Ad-sTRAIL；并以該載體感染前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，結(jié)果表明經(jīng)Ad-sTRAIL感染組腫瘤細(xì)胞凋亡水平明顯增加；同時(shí)Ad-sTRAIL還抑制了PC3細(xì)胞的侵襲能力。TRAIL蛋白表達(dá)水平增加導(dǎo)致其與死亡受體結(jié)合增加，誘導(dǎo)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域變構(gòu)，從而催化裂解Caspase-8前體，激活形成活化型Caspase-8，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論，DAPI染色顯示Ad-sTRAIL感染前列腺癌細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞凋亡水平顯著提升，出現(xiàn)皺縮，胞漿致密，核染色質(zhì)邊集，并且胞核裂解，形成含核碎片和細(xì)胞器成份的凋亡小體。另外，Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示Ad-sTRAIL感染后細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力明顯降低。進(jìn)一步荷瘤鼠實(shí)驗(yàn)表明，Ad-sTRAIL組的荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)能力顯著降低，證明Ad-sTRAIL在體內(nèi)亦能發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。免疫組化實(shí)驗(yàn)及TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)，荷瘤鼠腫瘤組織中TRAIL表達(dá)水平的增加導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞凋亡水平的增加。

圖4 TRAIL蛋白在3組荷瘤鼠腫瘤組織中的表達(dá)（×200）Fig.4 The expression of TRAIL protein in tumors of three groups tumor-bearing mice（× 200）

圖5 Ad-sTRAIL對(duì)3組荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響（×200）Fig.5 The effects of Ad-sTRAIL on tumor cells apoptosis of three groups tumor-bearing mice（× 200）

綜上所述，通過(guò)提高TRAIL的表達(dá)在體內(nèi)外均可以抑制PC-3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其具體機(jī)制可能是通過(guò)增加前列腺癌細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)來(lái)活化Caspase-3和Caspase-8達(dá)到促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用。本研究成功在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了Ad-sTRAIL抗腫瘤效果，為下一步的臨床抗腫瘤研究奠定了基礎(chǔ)。

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