GRIK3胞內(nèi)區(qū)蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)和純化

高永輝 肖斌 劉明 廖揚(yáng) 唐榮芝 孫朝暉 李林海

中國(guó)人民解放軍廣州總醫(yī)院（廣州 510010）

谷氨酸是一種中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與機(jī)體多種重要的生理活動(dòng)及病理改變。細(xì)胞膜表面的谷氨酸受體是游離谷氨酸發(fā)揮生物學(xué)功能的重要媒介［1-2］。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體，其中離子型谷氨酸受體又分為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate receptors，NMDA）受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4異惡唑丙酸（α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoazolepropionic acid，AMPA）受體和紅藻氨酸受體（Kainate receptors，KARs）。離子型谷氨酸受體紅藻氨酸受體亞基3（glutamate ionotropic receptor kainate type subunit 3，GRIK3）是 KARs家族的 5種亞型（GRIK1、GRIK2、GRIK3、KA1、KA2）中的一員。研究表明GRIK1、GRIK2和GRIK3既可自身組合形成功能性的同質(zhì)性聚合體，也可彼此互相組裝形成有功能的異聚復(fù)合體［3-4］，兩者均在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。目前有關(guān)GRIK3的大部分研究都集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能和作用機(jī)制已經(jīng)研究的較為詳盡［5］，但是關(guān)于GRIK3在其他系統(tǒng)和疾病中作用機(jī)制的研究卻非常有限。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，GRIK3在心臟、胰腺、肺等外周組織也有廣泛表達(dá)［6］，亦有報(bào)道稱，GRIK3在橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、甲狀腺腫瘤、肺癌、星形細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中均有高表達(dá)［7］。谷氨酸受體的過表達(dá)對(duì)于腫瘤微環(huán)境中具有高濃度谷氨酸的腫瘤組織的生長(zhǎng)極為重要［8］，并可能影響腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能［9］。另外已證實(shí)NMDA受體家族能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生化代謝和增殖能力［10］。本課題組前期對(duì)GRIK3在乳腺癌中的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步探索，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GRIK3能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖與遷移，而敲低GRIK3顯著抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的增殖與遷移（未發(fā)表）。為了深入研究GRIK3在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，本課題組2017年3-11月擬篩選并鑒定GRIK3的直接相互作用蛋白。膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)是與胞內(nèi)第二信使相互作用和介導(dǎo)蛋白構(gòu)象變化的重要區(qū)域。為此，我們需要獲得純化的GRIK3胞內(nèi)段蛋白并進(jìn)行GST pull down實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌種 Rosseta菌株、pCzn1質(zhì)粒、TOP10菌株均購(gòu)自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 Tyrptone、Yeast Extract購(gòu)自 OXOID公司；IPTG、Acr、Bis、Tris購(gòu)自Sigma公司；Agarose購(gòu)自上海基因公司；限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI購(gòu)自TaKaRa公司；DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；SDS購(gòu)自Amresco公司；0.22 μm無菌濾器和透析袋購(gòu)自Millipore公司；TEMED購(gòu)自BIO-RAD公司；Protein Marker購(gòu)自Thermo公司；Ni2+IDA親和層析膠購(gòu)自Novagen公司；Pfu DNA聚合酶購(gòu)自zoonbio公司，貨號(hào)PC12；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 儀器 AR5120電子天平（美國(guó)AHOM S公司）；Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini ProteanⅡ垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）；320-S pH計(jì)（美國(guó)Mettler Toledo公司）；MultiTempⅢ恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀（美國(guó)Amersham Pharmacia公司）；PTC-200基因擴(kuò)增儀（美國(guó)MJ Research公司）；雪花狀制冰機(jī)（日本SANYO公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)SORVAL公司）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（中國(guó)新芝科器研究所）；Allegra 21R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；超凈工作臺(tái)（中國(guó)蘇凈集團(tuán)）；NANODROP2000（Thermo公司）。

1.4 GRIK3表達(dá)區(qū)段的選擇及重組質(zhì)粒構(gòu)建按照 Uniprot網(wǎng)站（http：//www.uniprot.org/uniprot/Q13003）數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)于GRIK3蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的描述，選擇GRIK3胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行表達(dá)，GRIK3各區(qū)段截?cái)嘈蛄蟹植既鐖D1所示，胞內(nèi)區(qū)DNA序列由華大基因完成合成拼接（圖2）。

圖1 GRIK3蛋白的胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)Fig.1 The intracellular regions，transmembrane regions and extraellular regions of GRIK3 protein

圖2 GRIK3蛋白的胞內(nèi)區(qū)拼接序列Fig.2 The splicing intracellular sequence of GRIK3 protein

使用限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI分別對(duì)合成的DNA序列和pCzn1空載體進(jìn)行雙酶切，然后把酶切后的DNA和線性化載體進(jìn)行連接反應(yīng)，將獲得的重組質(zhì)粒pCzn1-GRIK3轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株后挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和原始序列對(duì)比無誤。

1.5 質(zhì)粒酶切鑒定 以限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行切割，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)pCzn1線性化載體和GRIK3胞內(nèi)區(qū)分子量的大小。

1.6 pCzn 1-GRIK3載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta把1 μL重組質(zhì)粒加入100 μL感受態(tài)細(xì)菌中，放置在冰上20 min；42℃熱激90 s后迅速放在冰中5 min；加入600 μL LB培養(yǎng)液，37℃，220 r/min振搖 1 h，離心后全部涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.7IPTG誘導(dǎo)pCZN1-GRIK3載體融合蛋白的表達(dá) 挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種在含50 μg/mL AMP的3 mL LB培養(yǎng)液的試管之中，37℃220 r/min振搖過夜；第2天按 1∶100接種于50 μg/mL AMP的30 mL LB培養(yǎng)液中，37℃220 r/min振搖菌體至OD600為0.6～0.8（大約 2 h）；取出1 mL培養(yǎng)物，室溫10 000g離心2 min，棄去上清液后用100 μL 1×上樣緩沖液使菌體沉淀重懸；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG直到終濃度為0.5 mmol/L，對(duì)rosseta菌種37℃誘導(dǎo)4 h即可誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；取出1 mL培養(yǎng)物，室溫10 000g離心2 min，棄去上清液后用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。重懸培養(yǎng)物4 000g離心10 min，棄去上清液，用PBS使菌體沉淀重懸；重懸液進(jìn)行超聲波破碎后離心并分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸；進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.8 融合蛋白的Ni柱親和純化 利用低壓層析系統(tǒng)，將上清液以0.5 mL/min流速上樣至已通過Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱；再用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速?zèng)_洗，至流出液的OD280值到達(dá)基線；用 Ni-IDA Washing-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L 咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速?zèng)_洗，至流出液的OD280值到達(dá)基線；最后用 Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L 咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）洗脫目的蛋白，流速為1 mL/min；收集流出液并加入透析袋中，使用 20 mmol/L Tris-HCl，0.10 mol/L NaCl，pH 8.0進(jìn)行透析過夜；進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒酶切鑒定 瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，雙酶切后GRIK3胞內(nèi)區(qū)基因片段在500～750 bp之間，與目的基因的預(yù)期分子量大小相符。重組質(zhì)粒送華大基因測(cè)序后證實(shí)插入基因序列正確，無突變、缺失等情況。見圖3。

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分析，目的蛋白主要存在于上清中（圖4），目標(biāo)條帶（含His標(biāo)簽）的相對(duì)分子質(zhì)量約18 kD，大小與蛋白質(zhì)的理論分子量17.204 kD相符，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液表達(dá)產(chǎn)物在相同位置沒有明顯的目標(biāo)條帶。

圖3 重組質(zhì)粒pCzn1-GRIK3的雙酶切鑒定Fig.3 The double enzyme digestion of the recombinant plasmid pCzn1-GRIK3

圖4 GRIK3蛋白胞內(nèi)區(qū)原核表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expressed GRIK3-intra

2.3 Ni柱純化結(jié)果分析 通過Ni柱親和純化目的蛋白GRIK3胞內(nèi)段，經(jīng)SDS-PAGE分析，洗脫液中可見清晰且單一的目標(biāo)條帶（圖5），而未純化的透析液和流出液中除目標(biāo)條帶以外，還含有明顯的雜帶，表明成功純化了GRIK3胞內(nèi)區(qū)。

3 討論

谷氨酸受體家族的各亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮重要作用，然而在其他惡性腫瘤中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制仍有待發(fā)現(xiàn)。GRIK3是谷氨酸受體中的紅藻氨酸受體亞型成員之一。在腦組織中，紅藻氨酸受體參與突觸神經(jīng)信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)；GRIK3受體富集于海馬回突觸前部位，并通過紅藻氨酸受體促進(jìn)突觸神經(jīng)傳遞。

近年來，多項(xiàng)研究表明紅藻氨酸受體在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到關(guān)鍵作用。STEPULAK等［7］證實(shí)所有的谷氨酸受體亞單位在多種腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)，且紅藻氨酸受體亞型表達(dá)水平較其他受體亞基更高。紅藻氨酸受體家族的各亞型蛋白，在特定腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。LI等［11］利用全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）表明GRIK1是HBV引起的肝癌的易感性基因位點(diǎn)；WU等［12］發(fā)現(xiàn)GRIK2是胃癌的腫瘤抑制因子，在胃癌發(fā)生過程中，GRIK2的啟動(dòng)子被甲基化而抑制GRIK2的基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)了胃癌的發(fā)展；PRADHAN等［13］證實(shí)GRIK3基因在肺腺癌的不同病理階段均被甲基化。基于以上研究，筆者認(rèn)為GRIK3可能在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但GRIK3的相互作用蛋白和相關(guān)信號(hào)通路仍不清楚。另外，HUAN等［14］和LIU等［15］認(rèn)為GRIK3通過神經(jīng)活性配體-受體途徑相互作用，并且與乳腺癌、結(jié)腸癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)；BAO等發(fā)現(xiàn)GRIK3的過度表達(dá)與淋巴瘤的轉(zhuǎn)移、YNM分期以及預(yù)后均相關(guān)，提示GRIK3是淋巴瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。這些研究均表明GRIK3可能成為特定腫瘤的潛在檢測(cè)靶標(biāo)，也提示GRIK3拮抗劑可能是未來治療特定腫瘤的有效手段。

圖5 GRIK3胞內(nèi)區(qū)蛋白純化后SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified GRIK3-intra

由于GRIK3為細(xì)胞膜蛋白，其分子量較大且蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，經(jīng)軟件預(yù)測(cè)含有大量的疏水性結(jié)構(gòu)，進(jìn)行全長(zhǎng)表達(dá)較為困難。而膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)是傳遞胞外信號(hào)并激活胞內(nèi)第二信使的重要環(huán)節(jié)，是膜蛋白功能的重要執(zhí)行者。故本次實(shí)驗(yàn)根據(jù)Uniprot網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)于GRIK3蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的描述，選擇GRIK3胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行表達(dá)。但是本實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)目的蛋白進(jìn)行活性驗(yàn)證，蛋白的活性是否受到影響這有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

總之，本研究成功構(gòu)建出插入序列正確的GRIK3胞內(nèi)區(qū)原核表達(dá)質(zhì)粒pCZN1-GRIK3，在E.coli系統(tǒng)中高效表達(dá)并以Ni柱親和層析方式純化了目的蛋白，為探究膜蛋白GRIK3的相互作用蛋白及其下游信號(hào)通路、闡明GRIK3的生物學(xué)作用提供了有價(jià)值的研究工具。

［1］RIBEIRO M P，CUSTODIO J B，SANTOS A E.Ionotropic glutamate receptor antagonists and cancer therapy：time to think out of the box？［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2017，79（2）：219-225.

［2］TRAYNELIS S F，WOLLMUTH L P，MCBAIN C J，et al.Glutamate receptor ion channels：structure，regulation，and function［J］.Pharmacol Rev，2010，62（3）：405-496.

［3］LERMA J，PATERNAIN A V，RODRIGUEZ-MORENO A，et al.Molecular physiology of kainate receptors［J］.Physiol Rev，2001，81（3）：971-998.

［4］侯文婷，劉曉湘，曹德壽.KA受體的研究進(jìn)展［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2004，10（2）：150-154.

［5］袁磊，龔濟(jì)欽，張海霞，等.紅藻氨酸受體與神經(jīng)退行性變疾病相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué)，2014，7（4）：367-371.

［6］高雪.心臟促離子型谷氨酸受體功能的研究［D］.中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，北京：2006.

［7］STEPULAK A，LUKSCH H，GEBHARDT C，et al.Expression of glutamate receptor subunits in human cancers［J］.Histochem Cell Biol，2009，132（4）：435-445.

［8］LUKSCH H，UCKERMANN O，STEPULAK A，et al.Silencing of selected glutamate receptor subunits modulates cancer growth［J］.Anticancer Res，2011，31（10）：3181-3192.

［9］RZESKI W，TURSKI L，IKONOMIDOU C.Glutamate antagonists limit tumor growth［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（11）：6372-6377.

［10］STEPULAK A，SIFRINGER M，RZESKI W，et al.NMDA antagonist inhibits the extracellular signal-regulated kinase pathway and suppresses cancer growth［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（43）：15605-15610.

［11］LI S，QIAN J，YANG Y，et al.GWAS identifies novel susceptibility loci on 6p21.32 and 21q21.3 for hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B virus carriers［J］.PLoS Genet，2012，8（7）：e1002791.

［12］WU C S，LU Y J，LI H P，et al.Glutamate receptor，ionotropic，kainate 2 silencing by DNA hypermethylation possesses tumor suppressor function in gastric cancer［J］.Int J Cancer，2010，126（11）：2542-2552.

［13］PRADHAN M P，DESAI A，PALAKAL M J.Systems biology approach to stage-wise characterization of epigenetic genes in lung adenocarcinoma［J］.BMC Syst Biol，2013，7：141.

［14］HUAN J，WANG L，XING L，et al.Insights into significant pathways and gene interaction networks underlying breast cancer cell line MCF-7 treated with 17beta-estradiol（E2）［J］.Gene，2014，533（1）：346-355.

［15］LIU Y，WANG L，WANG B，et al.Pathway analysis based on attractor and cross talk in colon cancer［J］.Dis Markers，2016，2016：2619828.