草氨酸鈉抑制乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2血管緊張素Ⅱ生成提高放射敏感性

程坦 鄭杰靈 劉穎 謝國(guó)柱 袁亞維

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科（廣州510515）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是鼻咽部起源的最常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于中國(guó)東南部、東南亞地區(qū)，并以廣東最為高發(fā)［1］。目前，放射治療（放療）或以放療為主的綜合治療是鼻咽癌的主要治療手段。雖然初診未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者綜合治療后5年生存率已接近85%左右，但仍有部分患者因局部復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移未能獲得長(zhǎng)期生存［2-3］。包括鼻咽癌在內(nèi)的大多數(shù)實(shí)體瘤中廣泛存在乏氧，乏氧也被公認(rèn)為是腫瘤對(duì)包括放療在內(nèi)的多種治療手段抵抗的重要原因。因此，改善腫瘤組織內(nèi)乏氧的腫瘤細(xì)胞的放射抵抗對(duì)提高鼻咽癌患者的放療療效具有重要的意義［4-5］。腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下，仍然主要通過(guò)糖酵解獲取能量［6］。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是催化腫瘤細(xì)胞胞漿中乳酸生成的糖酵解的關(guān)鍵酶之一。以往研究表明LDH-A抑制劑草氨酸鈉對(duì)體外常氧培養(yǎng)的胃癌、肺癌細(xì)胞有一定的生長(zhǎng)抑制作用。但草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞的增殖以及放射敏感性的影響卻罕見(jiàn)報(bào)道。在此筆者使用草氨酸鈉干預(yù)體外乏氧培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞CNE2，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、放射敏感性的影響，初步探討其潛在機(jī)制，為進(jìn)一步的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 顯微鏡（日本Olympus公司）；人鼻咽癌細(xì)胞CNE2為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科實(shí)驗(yàn)室凍存；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶（美國(guó)Gibco公司）；南美胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；PBS溶液（美國(guó)Hyclone公司）；100X青鏈霉素溶液（美國(guó)Gibco公司）；草氨酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司），純度＞98%；乳酸測(cè)定試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；人血管緊張素ⅡELISA試劑盒（美國(guó)Ray Biotech公司）；DMSO、MTT粉劑（美國(guó)Sigma公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE2細(xì)胞株采用含10%胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)液置5%CO2，37℃孵箱培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用PBS溶液清洗2次，然后0.25%胰酶消化，終止消化后反復(fù)吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后平鋪置96孔板、6孔板或培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞乏氧時(shí)，將貼壁后的細(xì)胞置于充滿5%CO2、95%N2混合氣體，O2濃度維持在1%的37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)乳酸含量測(cè)定 向常氧、乏氧條件下培養(yǎng)的已貼壁的CNE2鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入草氨酸鈉溶液（草氨酸鈉終濃度為20 mmol/L），對(duì)照組加入等體積的PBS。培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)基，用PBS液清洗2次，然后用0.25%胰酶消化，終止消化后1 000 r/min離心5 min得沉淀的細(xì)胞。用PBS重懸清洗細(xì)胞后再次離心，向裝有細(xì)胞的EP管中加入已預(yù)冷的生理鹽水并置于冰上勻漿。將制備好的勻漿4℃3 000 r/min離心15 min，吸取上清并按乳酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書要求操作測(cè)定乳酸含量。

1.2.3 上清中血管緊張素Ⅱ含量測(cè)定 在24孔板內(nèi)接種2×105個(gè)/孔狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，并加入1 mL培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別接受20 mmol/L和等體積PBS處理，乏氧培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)基上清至離心管內(nèi)，按照血管緊張素Ⅱ檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定上清中血管緊張素Ⅱ含量。

1.2.4 四氮噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn) 接種于96孔板的細(xì)胞乏氧條件培養(yǎng)12 h后分別加入經(jīng)培基稀釋的不同濃度草氨酸鈉（終濃度分別為30、60、90 mmol/L），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的培養(yǎng)液），各組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置孵箱中繼續(xù)乏氧培養(yǎng)，藥物作用24、48、72 h后，取出相應(yīng)的96孔板每孔分別加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄各孔液體，每孔加入150 μL DMSO，振蕩待藍(lán)色晶體溶解后酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度（A490）值，確定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)（colony formation assay）檢測(cè)細(xì)胞的放射敏感性［7］用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2鼻咽癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔200、400、2 000、4 000、和10 000個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，每個(gè)劑量接種3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，草氨酸鈉組和對(duì)照組分別用20 mmol/L草氨酸鈉溶液和PBS液繼續(xù)培養(yǎng)24 h并給予0、2、4、6、8 Gy的6 MV X線滿射野照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)9 d，取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，用1XPBS清洗2次，甲醛固定15 min。棄去固定液并用0.1%結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下技術(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆。以0 Gy組克隆形成率為對(duì)照，計(jì)算出各個(gè)劑量組的細(xì)胞存活率?？寺⌒纬陕剩≒E）=對(duì)照組克隆數(shù)（0 Gy組克隆數(shù)）/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)（SF）=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/（接種細(xì)胞數(shù)×PE）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本的比較采用單向方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 草氨酸鈉抑制CNE2細(xì)胞乳酸的生成 細(xì)胞內(nèi)乳酸水平檢測(cè)結(jié)果顯示，即使在常氧條件下，CNE2細(xì)胞內(nèi)也有較多的乳酸積累，乏氧條件下乳酸水平進(jìn)一步提升。加入草氨酸鈉處理后，兩種條件下的CNE2細(xì)胞乳酸水平均顯著降低。見(jiàn)圖1。

圖1 草氨酸鈉處理對(duì)CNE2細(xì)胞乳酸含量的影響Fig.1 Effect of sodium oxalate on the production of lactate in CNE2 cells

2.2 草氨酸鈉抑制腫瘤細(xì)胞血管緊張素的生成常氧條件下，CNE2細(xì)胞僅產(chǎn)生少量的血管緊張素Ⅱ，乏氧條件下CNE2細(xì)胞上清血管緊張素Ⅱ含量明顯增多。20 mmol/L草氨酸鈉處理可減少兩種條件下腫瘤細(xì)胞血管緊張素Ⅱ的分泌。見(jiàn)圖2。

2.3 草氨酸氨對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)30、60、90 mmol/L不同濃度草氨酸鈉處理不同時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性（表1），與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖2 草氨酸鈉處理對(duì)CNE2細(xì)胞上清血管緊張素Ⅱ含量的影響Fig.2 Effect of sodium oxalate on the production of angiotensinⅡin CNE2 cells

表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s，%

表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s，%

草氨酸鈉濃度（mmol/L）30 60 90作用時(shí)間24 h 2.68±0.59 13.83±3.21 30.61±5.46 48 h 11.45±2.44 23.97±5.54 47.99±10.26 72 h 15.97±4.21 32.50±4.67 59.75±9.73

2.4 草氨酸鈉增加了乏氧腫瘤細(xì)胞的放射敏感性 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，草氨酸鈉降低了乏氧條件下培養(yǎng)的CNE2細(xì)胞經(jīng)不同劑量照射后的存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）（圖3），提高了乏氧CNE2細(xì)胞的放射敏感性。

圖3 草氨酸鈉對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.3 Effect of sodium oxalate on the radiosensitivity of hypoxic CNE2 cells

3 討論

近年來(lái)，隨著放射生物學(xué)，尤其是放射物理學(xué)的快速發(fā)展，鼻咽癌放療臨床獲益顯著，但仍有部分患者因局部區(qū)域腫瘤的復(fù)發(fā)和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗。造成這一局面的重要原因是腫瘤細(xì)胞的放射生物學(xué)抵抗［8］。同其他實(shí)體瘤一樣，鼻咽癌也存在瘤內(nèi)的乏氧，與普通細(xì)胞相比乏氧的腫瘤細(xì)胞對(duì)射線有更強(qiáng)的抵抗力，在放療中這部分細(xì)胞不易被殺死，成為治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在根源［9］。因此克服乏氧腫瘤細(xì)胞放射抵抗仍然是目前惡性腫瘤放射治療面臨的重要挑戰(zhàn)。

能量代謝異常是惡性腫瘤最鮮明的特征之一，雖然與氧化磷酸化相比糖酵解是一種低效的能量代謝方式，但是腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下仍活躍地?cái)z取葡萄糖進(jìn)行糖酵解來(lái)供應(yīng)能量。腫瘤細(xì)胞的這種能量代謝方式被稱作“有氧糖酵解”或“Warburg效應(yīng)”［6］。LDH是調(diào)節(jié)糖酵解的重要酶之一，在胞漿內(nèi)催化糖酵解途徑的產(chǎn)物丙酮酸生成乳酸完成糖酵解全過(guò)程。草氨酸鈉（sodium oxamate）是LDH-A（LDH的5種同工酶之一）的特異性抑制劑，可抑制癌細(xì)胞糖酵解的發(fā)生，阻斷癌細(xì)胞的能量供應(yīng)來(lái)源［10］。YAND等［11］在人肺腺癌H1395中發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并引起G2/M期阻滯。LIU等［12］使用草氨酸鈉處理胃癌SGC-7901細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可抑制其增殖并降低細(xì)胞的侵襲性，誘導(dǎo)它們發(fā)生凋亡。ZHAO等［13］也在胃癌細(xì)胞中得到了相一致的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。

在此，本課題組研究了草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2體外增殖和放射敏感性的影響，及其潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，由于“Warburg效應(yīng)”的存在，鼻咽癌細(xì)胞CNE2即使在常氧條件下仍有較多的乳酸生成，乏氧條件下乳酸的產(chǎn)生進(jìn)一步增多。草氨酸鈉在兩種條件下均能夠顯著抑制乳酸的生成。相似地，在乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2中，草氨酸鈉也可呈時(shí)間和劑量依賴性抑制其增殖。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用［14］，近年來(lái)的研究顯示其參與了腫瘤的化學(xué)治療、免疫治療抵抗［15-16］。血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）被認(rèn)為是RAS最主要的生物活性物質(zhì)。本課題組之前的研究顯示乏氧腫瘤中AngⅡ水平明顯升高，血管緊張素Ⅱ受體1型（AngiotensinⅡreceptor type 1，AT1R）信號(hào)阻斷可提高乏氧鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性［17-19］。為研究草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞AngⅡ水平的影響，筆者檢測(cè)了CNE2上清中AngⅡ的含量發(fā)現(xiàn)無(wú)論常氧還是乏氧條件下草氨酸鈉均可抑制鼻咽癌細(xì)胞AngⅡ的生成?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)證實(shí)了草氨酸鈉可顯著提高乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2的放射敏感性，因此筆者推測(cè)，其抑制AngⅡ的生成，下調(diào)AT1R信號(hào)可能是草氨酸鈉放射增敏效應(yīng)的機(jī)制之一，但仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

草氨酸鈉因其對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性較低，作為新型放射增敏劑具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者將繼續(xù)深入研究草氨酸鈉抑制乏氧腫瘤細(xì)胞AngⅡ生成，增強(qiáng)放射敏感性的分子機(jī)制并為動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。總之，本研究為理解乏氧腫瘤細(xì)胞放射抵抗的機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)為克服鼻咽癌放療抵抗從而減少放療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的潛在策略與手段。

［1］TANG L L，CHEN W Q，XUE W Q，et al.Global trends in incidence and mortality of nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer Lett，2016，374（1）：22-30.

［2］HUANG T L，CHIEN C Y，TSAI W L，et al.Long-term late toxicities and quality of life for survivors of nasopharyngeal carcinoma treated with intensity-modulated radiotherapy versus non-intensity-mod μLated radiotherapy［J］.Head Neck，2016，38（S1）：E1026-E1032.

［3］ZHANG L，HUANG Y，HONG S，et al.Gemcitabine plus cisplatin versus fluorouracil plus cisplatin in recurrent or metastatic nasopharyngeal carcinoma：a multicentre，randomised，open-label，phase 3 trial［J］.Lancet，2016，388（10054）：1883-1892.

［4］WILSON W R，HAY M P.Targeting hypoxia in cancer therapy［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（6）：393-410.

［5］COLLIEZ F，GALLEZ B，JORDAN B F.Assessing tumor oxygenation for predicting outcome in radiation oncology：a review of studies correlating tumor hypoxic status and outcome in the preclinical and clinical settings［J］.Front Oncol，2017，7：10.

［6］CHEN X，QIAN Y，WU S.The Warburg effect：evolving interpretations of an established concept［J］.Free Radical Bio Med，2015，79（4）：253-263.

［7］BREE C V，RODERMOND H M，HAVEMAN J，et al.Clonogenic assay of cells in vitro.［J］.Nat Protoc，2006，1（5）：2315-2319.

［8］PERRI F，PACELLI R，CELLA L，et al.Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma：Biological bases and therapeutic implications［J］.Head Neck，2015，37（5）：763-770.

［9］HIROSHI H.Hypoxia-inducible factor 1-mediated characteristic features of cancer cells for tumor radioresistance［J］.J Radiat Res，2016，57（Suppl 1）：i99-i105.

［10］KINNAIRD A，MICHELAKIS E D.Metabolic modulation of cancer：a new frontier with great translational potential［J］.J Mol Med，2015，93（2）：127-142.

［11］YANG Y，SU D，ZHAO L，et al.Different effects of LDH-A inhibition by oxamate in non-small cell lung cancer cells［J］.Oncotarget，2014，5（23）：11886.

［12］LIU X，YANG Z，CHEN Z，et al.Effects of the suppression of lactate dehydrogenase A on the growth and invasion of human gastric cancer cells［J］.Oncol Rep，2015，33（1）：157-162.

［13］ZHAO Z，HAN F，YANG S，et al.Oxamate-mediated inhibition of lactate dehydrogenase induces protective autophagy in gastric cancer cells：Involvement of the Akt-mTOR signaling pathway［J］.Cancer Lett，2015，358（1）：17-26.

［14］GEORGE A J，THOMAS W G，HANNAN R D.The renin-angiotensin system and cancer：old dog，new tricks［J］.Nat Rev Cancer，2010，10（11）：745-759.

［15］CHAUHAN V P，MARTIN J D，LIU H，et al.Angiotensin inhibition enhances drug delivery and potentiates chemotherapy by decompressing tumour blood vessels［J］.Nat Commun，2013，4（10）：2516.

［16］PINTER M，JAIN R K.Targeting the renin-angiotensin system to improve cancer treatment：Implications for immunotherapy.［J］.Sci Transl Med，2017，9（410）：eaan5616.

［17］林淑慧，謝國(guó)柱，張靜芳，等.坎地沙坦對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7生長(zhǎng)抑制作用的研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（4）：511-514.

［18］劉穎，張?zhí)m芳，程坦，等.坎地沙坦提高乏氧鼻咽癌CNE1細(xì)胞輻射敏感性［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（8）：1212-1216.

［19］XIE G，LIU Y，YAO Q，et al.Hypoxia-induced angiotensin II by the lactate-chymase-dependent mechanism mediates radioresistance of hypoxic tumor cells［J］.Sci Rep，2017，7：42396.