甲強龍對腦出血后灶周MMP-9 表達及其 神經(jīng)損傷的保護作用*

毛珂 雷町 游潮 肖安琪 鄭松平 陳銳奇 任艷明

(四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科,四川 成都 610041)

自發(fā)性腦出血(Intracranial Hemorrhage， ICH)是臨床上常見的出血性卒中[1]，在我國發(fā)病率約為60～80/10萬人口/年。其起病突發(fā)而兇險，有很高的致殘率和死亡率[2]。有文獻報道，死亡率可高達20%～75%，而且多數(shù)幸存者發(fā)病后遺留顯著神經(jīng)功能障礙[3]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的蛋白酶，后者是構(gòu)成血管基底膜的主要成分，其完整性在一定程度上決定著血管的完整性[4]。大量的動物研究表明，MMP-9能在腦外傷、腦缺血性卒中以及出血性卒中高表達。它不僅能通過溶解血腦屏障基膜，引起血源性水腫，亦能介導(dǎo)炎性反應(yīng)加重炎性浸潤，甚至參與觸發(fā)周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[2-5]。

甲強龍是被臨床廣泛使用的糖皮質(zhì)激素[5]，其在神經(jīng)領(lǐng)域中主要用于減輕嚴(yán)重的腦水腫與垂體激素的替代治療。有研究表明，糖皮質(zhì)激素能通過有效抑制 MMP-9的表達情況，改善腦缺血，降低炎性反應(yīng)，減少腦水腫和神經(jīng)功能損傷[6]。探討本實驗通過對比觀察甲強龍干預(yù)后的腦出血大鼠及對照空白組腦出血后的腦水腫程度、神經(jīng)功能評分、活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、以及MMP-9蛋白表達情況，以論證甲強龍對腦出血后的神經(jīng)保護作用，同時進一步探討腦出血繼發(fā)神經(jīng)功能損傷的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠 30只(230～260g)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物隨機分為四組，即假手術(shù)對照組、腦出血組、甲強龍干預(yù)組、空白對照組，每組各7只。于四川大學(xué)高新區(qū)動物實驗室以標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠喂養(yǎng)。實驗室溫度：19～21°C；光照：12小時。術(shù)前4周每周以鼠尾無創(chuàng)血壓儀監(jiān)測并記錄收縮壓(SBP, systolic blood pressure)及平均動脈壓(MAP, mean arterial blood pressure)。實驗大鼠術(shù)前6小時禁食、禁飲。

1.1.2 實驗器材 智能無創(chuàng)鼠尾血壓儀購于澳大利亞PowerLab公司，立體定向儀購于成都光電儀廠，石蠟切片機購于德國Leica公司，主要試劑有10%水合氯醛、75%乙醇、5%聚維酮碘、伊紅酒精溶液、蘇木紫染色液、中性樹膠等。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立腦出血大鼠模型 術(shù)前將大鼠稱重后，用10%水合氯醛以0.4g/kg進行腹腔注射麻醉，放置約10分鐘使麻醉生效，水平固定大鼠頭部于立體定向儀，對術(shù)區(qū)進行備皮，以75%酒精棉簽擦洗術(shù)區(qū)并以2%碘伏消毒術(shù)區(qū)3遍。以10號圓刀沿正中矢狀線切開頭皮長約1.5cm，鹽水棉球分開皮膚及皮下組織暴露前囟。鉆孔點設(shè)定為前囟前方0.2mm、中線右側(cè)3mm。以微型手鉆鉆孔，孔徑約1mm。固定微量注射器(100ul型)于立體定向儀并調(diào)整儀器臂使針頭尖部恰好位于骨孔中。以無菌注射器穿刺鼠尾動脈抽取動脈血0.1ml，并迅速轉(zhuǎn)移至微量注射器中；垂直向下推進約5mm，緩慢注射大鼠自體血50ul，保持注射時間大于60秒。注射后留置注射器針頭10分鐘，再緩慢退出微量注射器。以骨蠟封閉骨孔，1號絲線仔細(xì)縫合頭皮并再次消毒。術(shù)畢，置大鼠于37°C溫箱蘇醒；假手術(shù)組依照相同操作方式向基底節(jié)區(qū)注射50ul生理鹽水。

1.2.2 甲強龍干預(yù)方法 分別在建模術(shù)后1小時及24小時后以35mg/kg的甲強龍(生理鹽水配液5ml/kg)腹腔注射；空白對照組在術(shù)后1小時及24小時后注射同等劑量生理鹽水，余同實驗組。

1.2.3 腦水腫測量 方法同前兩部分，利用干濕重法在基底節(jié)出血模型建立術(shù)第1、3、7天檢測腦組織含水量。公式：腦組織含水量=(濕重-干重)/ 濕重×100%。

1.2.4 神經(jīng)功能評分 依據(jù)神經(jīng)功能缺損評分表(Neurological Severity Score, NSS)，由兩名神經(jīng)外科醫(yī)師在基底節(jié)出血模型建立術(shù)后第1、3、7天對實驗大鼠進行評分。

1.2.5 免疫組化染色 術(shù)后第3天，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，開胸灌注心臟，固定并提取新鮮腦組織。置于4%多聚甲醛中固定24小時后依次給予75%、85%、95%、95%和100%各級乙醇進行脫水。之后放置在氯仿中透明并進行浸蠟包埋。用切片機對包埋好的腦組織蠟塊進行冠狀切片(層厚約5μm)。將切片貼于載玻片，放置60°C恒溫箱中烘烤。二甲苯溶解切片中的石蠟，經(jīng)各級乙醇至蒸餾水洗；3% H2O2進行溫室培育15分鐘，山羊血清工作液封閉后，一抗二抗依次孵育，入SABC于室溫下孵育20分鐘，PBS持續(xù)沖洗后，通過DAB顯色，蒸餾水沖洗后常規(guī)封片。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0軟件進行本實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。均數(shù)間的比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲強龍對腦出血后腦組織含水量的影響 測量四組大鼠術(shù)后第1、3、7天腦組織含水量。結(jié)果顯示，腦出血組腦組織含水量明顯高于假手術(shù)對照組(P<0.05)，甲強龍干預(yù)組的腦組織含水量均在各時間點均低于空白對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1假手術(shù)對照組、腦出血組、甲強龍干預(yù)組、空白對照組術(shù)后第1、3、7天的腦組織含水量

Figure1Watercontentofbraintissueonthe1st,3rd,7thdayafteroperationinshamoperationgroup,ICHgroup,methylprednisolonegroupandcontrolgroup

2.2 各組神經(jīng)功能評分 利用NSS表對四組實驗大鼠在術(shù)后第1、3、7天行神經(jīng)功能評分，結(jié)果顯示腦出血組神經(jīng)功能評分明顯低于假手術(shù)對照組(P<0.05)，甲強龍干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能評分均高于空白對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。2.3 各組免疫組化染色 術(shù)后第3天的OX-42免疫組化染色顯示腦出血組血腫周圍有大量內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，甲強龍干預(yù)組大鼠陽性細(xì)胞數(shù)少于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、圖4。

2.4 各組MMP-9 蛋白表達 Western Blot結(jié)果顯示，腦出血組大鼠的MMP-9蛋白表達明顯高于假性手術(shù)組(P<0.05)。甲強龍干預(yù)組的MMP-9蛋白表達較空白對照組明顯下降(P<0.05)，見圖5。

圖2假手術(shù)對照組、腦出血組、甲強龍干預(yù)組、空白對照組術(shù)后第1、3、7天的神經(jīng)功能評分

Figure2Neurologicalscoresonshamoperationgroup,cerebralhemorrhagegroup,methylprednisolonegroupandcontrolgrouponthe1st,3rd,7thdayafteroperation

圖3術(shù)后第3天的OX-42涂片顯示假手術(shù)對照組、腦出血組、甲強龍干預(yù)組、空白對照組術(shù)后的活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

Figure3OX-42smearsonpostoperativeday3showedthenumberofactivatedmicroglialcellsinshamoperationgroup,intracerebralhemorrhagegroup,methylprednisolonegroupandcontrolgroup

圖4 術(shù)后第3天的OX-42免疫組化染色顯示 Figure 4 OX-42 immunohistochemical staining on day 3 after surgery

3 討論

諸多破壞血腦屏障的途徑中，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達被證實在其中起著關(guān)鍵的致病作用[6]。MMPs 是一類鋅依賴性胞外蛋白酶家族，其中MMP-2主要參與新生血管形成，而MMP-9則主要參與水腫形成[7]。大量研究證實，MMP-9能降解血管壁的重要結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，細(xì)胞表面分子及其他細(xì)胞外物，增加血管滲透性并導(dǎo)致血源性腦水

圖5假手術(shù)對照組、腦出血組、甲強龍干預(yù)組、空白對照組術(shù)后MMP-9蛋白表達情況

Figure5MMP-9proteinexpressioninsham-operationcontrolgroup,ICHgroup,methylprednisolonegroupandblankcontrolgroup

腫[8]。我們實驗研究顯示，高血壓腦出血大鼠的MMP-9異常的高表達伴隨更加嚴(yán)重的腦水腫和神經(jīng)廢損，其結(jié)果和國外的研究報道基本一致。此外，MMP-9的過度表達能產(chǎn)生其他惡性的效應(yīng)，包括介導(dǎo)細(xì)胞死亡與炎性反應(yīng)。有研究觀察到缺失MMP-9基因的大鼠腦出血后神經(jīng)功能的廢損更輕[9]。目前 MMP-9是否參與自發(fā)性腦出血的發(fā)病機制尚不得而知。有研究報道，MMP-9參與了阿爾茨海默病患者的腦淀粉樣血管病出血[10]。

甲強龍是一種臨床上常見的合成類糖皮質(zhì)激素。大量研究表明糖皮質(zhì)激素能抑制氧自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，反向細(xì)胞內(nèi)鈣的積累，防止神經(jīng)退化，并且抑制血管性水腫、炎癥反應(yīng)和腦損傷[11]。目前甲強龍主要集中在垂體激素的替代治療以及顱腦外傷和腫瘤引起的腦水腫控制方面，而已有的糖皮質(zhì)類激素對自發(fā)性腦出血腦保護的研究報道非常有限。以往的地塞米松的腦出血動物研究表明，高劑量或早期給藥可能是有益的[12]，然而也有學(xué)者的研究表明，它不能改善神經(jīng)功能，甚至可能導(dǎo)致惡性結(jié)果[17]。

為探明甲強龍是否對腦出血后有神經(jīng)保護作用以及其保護機制，我們在這部分實驗中對比甲強龍干預(yù)組和對照組大鼠的腦水分含量，神經(jīng)功能評分，小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及 MMP-9的表達情況。通過對比兩組大鼠，甲強龍干預(yù)組的腦水腫程度與神經(jīng)功能評分較對照組大鼠在各時間點都有顯著好轉(zhuǎn)，同時活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量也明顯下降。在 MMP-9蛋白表達方面，甲強龍干預(yù)組的MMP-9相對對照組顯著被抑制。我們推測甲強龍是通過抑制MMP-9表達改善了繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷從而達到神經(jīng)保護的作用。Harkness發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素能部分抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化導(dǎo)致的MMP-9表達增加[13]，這一結(jié)果也是支持了我們的推論。 MMP-9的表達下調(diào)使繼發(fā)的血腦屏障破壞減少，從而直接減少血腫局部的血管源性腦水腫，還能通過調(diào)節(jié)水通道蛋白-4的表達降低圍ICH含水量[14]。在抗炎作用方面，甲強龍能通過抑制毛細(xì)血管擴張減輕白細(xì)胞浸潤和吞噬作用。雖其機制尚不清楚，然有研究提示MMP-9表達能促進小膠質(zhì)細(xì)胞活化[18]，說明甲強龍抑制MMP-9表達后其介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化伴隨減少。

甲強龍作為一種糖皮質(zhì)類激素，是否適用于治療腦出血后腦水腫以改善ICH的預(yù)后存在爭議。其主要原因為：①自發(fā)性腦出血患者往往除合并高血壓以外還合并其他全身基礎(chǔ)疾病，如糖尿病，動脈粥樣硬化等，使用甾體類激素可能加重其他基礎(chǔ)疾病情況，影響患者預(yù)后。有學(xué)者甚至認(rèn)為它在非腫瘤學(xué)的腦水腫方面的使用是有禁忌甚至是無效的，利尿劑和高滲療法是降低ICH患者水腫和顱內(nèi)壓的唯一行之有效的方法[15]。②目前針對出血性卒中使用甾體類藥物的基礎(chǔ)和臨床研究尚十分不足，特別是在安全的藥物計量和治療干預(yù)的時間窗方面研究尤為缺乏。③甾體類的副作用可能影響患者預(yù)后，如免疫下降，感染和胃腸道出血風(fēng)險增加。然而也有學(xué)者通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素在治療原發(fā)性幕上ICH未必不安全，甚至能改進ICH患者的生存質(zhì)量。若在較早的時間窗中，短時間使用高劑量的糖皮質(zhì)激素可能避免不利的影響，如高血糖癥，感染和消化道出血，且類固醇在卒中治療中減少腦水腫具有明顯的作用[16]。然而，欲進一步明確甲強龍對于治療自發(fā)性腦出血的臨床價值，仍需大量臨床以及動物模型研究。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果顯示，甲強龍通過抑制高血壓腦出血大鼠的MMP-9表達，能減少高血壓腦出血大鼠血腫局部的血管源性腦水腫，并通過抑制高血壓腦出血大鼠毛細(xì)血管擴張以及減輕白細(xì)胞浸潤和吞噬作用從而減少大鼠局部血腫的炎性程度。對腦出血大鼠具有神經(jīng)保護作用及保護機制，通過改善繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷從而達到神經(jīng)保護的作用。

【參考文獻】

[1]胡榮,馮華. 典型腦疾病——自發(fā)性腦出血研究進展與新理念[J].科技導(dǎo)報,2017, 35 (4):18-22.

[2]Adeoye O, Broderick JP. Advances in the management of intracerebral hemorrhage[J]. Nat Rev Neurol, 2010, 6(11): 593-601.

[3]Da Pian R, Bazzan A, Pasqualin A. Surgical versus medical treatment of spontaneous posterior fossa haematomas: a cooperative study on 205 cases[J]. Neurol Res, 1984, 6(3): 145-151.

[4]S Borrego-González，LB Romero-Sánchez，J Blázquez，etal. Nanostructured hybrid device mimicking bone extracellular matrix as local and sustained antibiotic delivery system[J]. 《Microporous & Mesoporous Materials》,2017,256:165-176.

[5]李棽麗,董有靜.甲強龍在圍手術(shù)期的使用范圍及效果[J].國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志， 2017.38(8).

[6]王利民,姬從花,孟強.高溫誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶9對體外血腦屏障模型claudin-1的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2017，19(9):979-983.

[7]Flaherty ML, Woo D, Haverbusch M,etal. Racial variations in location and risk of intracerebral hemorrhage[J]. Stroke, 2005, 36(5): 934-937.

[8]Mendelow AD, Gregson BA, Fernandes HM,etal. Early surgery versus initial conservative treatment in patients with spontaneous supratentorial intracerebral haematomas in the International Surgical Trial in Intracerebral Haemorrhage (STICH): a randomised trial[J]. Lancet, 2005, 365(5):387-397.

[9]Anderson CS, Huang Y, Arima H,etal. Effects of early intensive blood pressure-lowering treatment on the growth of hematoma and perihematomal edema in acute intracerebral hemorrhage: the Intensive Blood Pressure Reduction in Acute Cerebral Haemorrhage Trial (INTERACT)[J]. Stroke, 2010, 41:307-312.

[10] Qureshi AI, Palesch YY, Martin R,etal. Effect of systolic blood pressure reduction on hematoma expansion, perihematomal edema, and 3-month outcome among patients with intracerebral hemorrhage: results from the antihypertensive treatment of acute cerebral hemorrhage study[J]. Arch Neurol, 2010, 67:570-576.

[11] Mendelow AD, Gregson BA, Rowan EN,etal. Surgery for cerebral haemorrhage-STICH II trial - Authors' reply[J]. Lancet, 2013, 382(9902):1402.

[12] Siddique MS, Fernandes HM, Wooldridge TD,etal. Reversible ischemia around intracerebral hemorrhage: a single-photon emission computerized tomography study[J]. J Neurosurg, 2002, 96:736-741.

[13] Sun H, Li L, Zhou F,etal. The member of high temperature requirement family HtrA2 participates in neuronal apoptosis after intracerebral hemorrhage in adult rats[J]. J Mol Histol, 2013, 44(4): 369-379.

[14] Russell RWR. Observations on intracerebral aneurysms[J]. Brain, 1963,85:422-445.

[15] Martini SR, Flaherty ML, Brown WM,etal. Risk factors for intracerebral hemorrhage differ according to hemorrhage location[J]. Neurology, 2012, 79(23):2275-2282.

[16] Flaherty ML. Anticoagulant-associated intracerebral hemorrhage[J]. Semin Neurol, 2010,30(05):565-572.

[17] Roof RL, Zhang Q, Glasier MM,etal. Gender-specific impairment on Morris water maze task after entorhinal cortex lesion[J]. Behav Brain Res, 1993, 57: 47-51.

[18] EJ Lee,HS Kim.Inhibitory mechanism of MMP-9 gene expression by ethyl pyruvate in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J].Neuroscience Letters, 2011, 493(1-2): 38.